CHAPITRE V : PATHOGENIE-IMMUNITE
D. DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE
1.
MISE EN EVIDENCE DES ANTICORPS ANTI +HSDWR]RRQ FDQLV PAR LA TECHNIQUE D’ IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE (I.F.I.)Un test d’ Immunofluorescence indirecte (I.F.I.) pour +FDQLV a été mis au point en 1994 en Israël [143].
Ce test permet la détection d’ anticorps anti-+ FDQLV et utilise les gamétocytes d’ + FDQLV comme source d’ antigène, le substrat antigénique étant un frottis sanguin réalisé à partir du « buffy coat » d’ un chien parasité.
Le sérum canin à tester est mis en contact avec ce substrat antigénique puis les éventuels anticorps anti-+ FDQLV sont révélés par des immunoglobines de lapin conjuguées avec la fluorescéine et dirigées contre les Ig G de chien.
Sur le même principe, des immunoglobines de mouton fluorescentes dirigées contre les Ig M de chien peuvent être utilisées pour la détection de cette classe d’ anticorps [9].
Les Ig G apparaissent entre 22 à 43 jours post-infection et les Ig M un peu plus précocement, entre 16 et 39 jours post-infection [9].
Des titres en Ig G supérieurs ou égaux à 1 : 32 sont considérés comme positifs, tandis que la positivité pour les Ig M s’ établit pour des titres ≥ 1 : 10.
Le test semble relativement sensible : 9 chiens sur 10 présentent une parasitémie positive au moment du test et 6 chiens sur 7 sans parasitémie détectable au moment du test (mais ayant présenté un épisode de parasitémie 4 mois auparavant) ont présenté des titres en Ig G positifs [143].
La spécificité du test paraît bonne : sur 12 chiens témoins, tous se sont révélés négatifs [143].
En outre, l’ absence de réaction croisée avec %DEHVLDFDQLV, %DEHVLDJLEVRQLet (KUOLFKLDFDQLV a été démontrée.
La valeur du titre en anticorps chez les animaux positifs semble dépendre de différents facteurs.
Les chiens présentant des gamétocytes dans le sang circulant au moment du test ont des titres variant de 1 : 64 à 1 : 4 096 tandis que les animaux ayant présenté cet épisode de parasitémie 4 mois plus tôt ont des titres en anticorps plus faibles, de 1 : 32 à 1 : 256 [143].
Des titres de 1 : 64 à 1 : 512 ont néanmoins été trouvés chez des chiens pour lesquels aucun gamétocyte n’ avait pu être mis en évidence au moment du test.
Dans l’ étude de Baneth et al [14], parmi les chiens ayant des gamétocytes détectables sur frottis sanguin (1% des cas), ceux ayant un taux de parasitémie de 1% ont montré des titres en anticorps de 1 : 32, tandis qu’ un taux de parasitémie de 10 % s’ accompagnait de titres en anticorps de 1 : 256.
La durée de persistance des anticorps après un premier contact infectieux n’ est pas connue : dans l’ étude de Baneth et al. [16], 2 chiens ont montré une négativation des titres en Ig M à 33 et 36 jours post-inoculation alors que d’ autres travaux ont rapporté une persistance des anticorps sur plusieurs mois [14-16-143].
Cette durée varie probablement selon que le parasite est éliminé, persiste dans l’ organisme de façon latente sous forme schizogonique, ou encore, est détectable dans le sang circulant de façon transitoire ou permanente.
Ce test d’ immunofluorescence indirecte peut être utilisé :
- pour le diagnostic individuel d’ hépatozoonose à + FDQLV. C’ est un outil
particulièrement intéressant dans les cas d’ infection chronique sans parasitémie détectable ou avec une parasitémie très faible rendant la mise en évidence directe du parasite délicate, ou encore pendant la phase précoce de l’ infection chez des animaux présentant des signes cliniques évocateurs avant l’ apparition des gamétocytes dans le sang circulant.
- dans le cadre d’ une enquête sérologique à l’ échelle d’ une population. Une telle
enquête réalisée en Israël par Baneth et al. [14] a révélé 33,1% de chiens séropositifs alors que, sur la base de la mise en évidence des gamétocytes, la prévalence de la maladie était de 1% seulement.
La recherche des Ig G est la technique la plus couramment employée (infections chroniques, études sérologiques), les Ig G atteignant des titres plus élevés que les Ig M et donc plus aisément détectables.
En cas de tentative de diagnostic sérologique très précocement après un contact infectieux, la mise en évidence des Ig G peut être doublée de la recherche des Ig M.
Des tentatives d’ utilisation de ce test d’ immunofluorescence indirecte, utilisant des gamontes d’+FDQLV comme source d’ antigènes, ont été réalisées pour la détection d’ anticorps anti-+
DPHULFDQXP chez des chiens atteints d’ hépatozoonose nord-américaine. Elles se sont soldées
par un fort taux de faux négatifs (59%) ou par des sérologies faiblement positives [15-160].
2. MISE EN EVIDENCE DES ANTICORPS ANTI-+HSDWR]RRQ DPHULFDQXP PAR LA TECHNIQUE E.L.I.S.A.
Un test E.L.I.S.A. (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) indirect a été récemment mis au point aux U.S.A. pour la détection des anticorps anti-+DPHULFDQXP [105].
Des sporozoïtes d’+DPHULFDQXP sont utilisés comme source d’ antigène. Ces sporozoïtes, libérés des ookystes par action de bile in vivo (les ookystes ayant été collectés sur
$PEO\RPPD PDFXODWXP) sont traités aux ultrasons puis les antigènes obtenus sont mis en
solution, déposés sur un support solide en plastique et mis en contact avec le sérum canin à tester, dilué à 1 : 200.
Les éventuels anticorps présents dans le sérum sont ensuite révélés par un conjugué anti-Ig de chien couplé à une enzyme agissant sur un substrat chromogène.
L’ intensité de la coloration (ou densité optique) est proportionnelle à la concentration en anticorps.
Des densités optiques ≥0,90 sont considérées comme positives.
Ce test présente une spécificité de 96% et une sensibilité de 93% et pourrait être à l’ avenir développé comme un outil de diagnostic utilisable en routine, éventuellement complété par biopsie musculaire en cas de résultat sérologique négatif malgré des signes cliniques
Le délai d’ apparition des anticorps après infection n’ est pas connu avec précision. Sur des chiens infectés expérimentalement, des tests E.L.I.S.A. réalisés 2 à 3 semaines après exposition se sont révélés positifs.
La cinétique des anticorops n’ est pas connue : on pense que dans des cas d’ infection chronique, les anticorps sériques pourraient décroître avec le temps.
3. IMMUNOTRANSFERT OU WESTERN BLOT
Pour compléter la sérologie et mieux caractériser la réponse immune vis à vis des constituants antigéniques d’+FDQLV, une technique d’ immunotransfert a été récemment développée. Contrairement à l’ I.F.I. qui fournit une réponse globale, le Western Blot permet en effet de distinguer les différents anticorps en fonction de leur spécificité vis à vis des différents antigènes d’+HSDWR]RRQ.
Dans un premier temps, des gamontes d’+ FDQLV sont extraits de leucocytes infectés par passage dans une chambre à cavitation au nitrogène suivi d’ une centrifugation.
Ces gamontes sont ensuite solubilisés dans une solution-tampon puis les antigènes obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
Un immunotransfert est réalisé avec une dilution du sérum de chien à tester puis les anticorps de ce sérum sont mis en contact avec des immunoglobulines de lapin anti-IgG de chien et révélés par une réaction enzymatique.
Une étude a montré que, parmi plus de 15 antigènes ayant réagi avec les différents sérums testés (3 sérums de chiens infectés naturellement, 3 sérums de chiens infectés expérimentalement), 4 bandes protéiques à 107, 88, 63 et 28 kDa ont été reconnues nettement par tous les sérums examinés et 5 autres bandes à 120, 92, 72, 21 et 17 kDa ont réagi plus faiblement. 5 sérums sur 6 ont en outre réagi avec les bandes 123 et 112 kDa [15].
D’ autres auteurs ont démontré une réaction des anticorps de chiens infectés avec les bandes protéiques 250, 107, 88, 63, 37, 32, 30, 28 kDa [10].
La connaissance des différents antigènes d’+ FDQLV n’ est, on le voit, à l’ heure actuelle qu’ ébauchée et nécessite d’ autres essais d’ immunotransferts utilisant des antigènes d’+FDQLV totalement purifiés.
L’ immuno-empreinte d’ un Western Blot faisant réagir un sérum de chien infecté par +
DPHULFDQXP sur un support sensibilisé par des antigènes d’ +FDQLV a montré un certain degré
de réactions croisées : le sérum anti-+DPHULFDQXP a reconnu intensément les bandes situées à 250, 107, 88 kDa et de façon moins marquée les bandes à 63 et 37 kDa, mais n’ a pas réagi avec les bandes 32, 30 et 28 kDa à la différence du sérum anti-+FDQLV [10].
+ DPHULFDQXP et + FDQLV sont, comme l’ avait déjà laissé supposer les tentatives d’ I.F.I.
croisées, proches mais distincts sur le plan antigénique, et induisent un certains nombre de réactions croisées.
Le développement d’ outils diagnostiques basés sur la connaissance des constituants antigéniques d’+ FDQLV et d’ + DPHULFDQXP facilitera à l’ avenir l’ examen des relations antigéniques possibles entre des +HSDWR]RRQ provenant de zones géographiques différentes ou parasitant des hôtes vertébrés distincts.