Liste des tableaux, figures, et abréviations
VII. Diagnostic des infections à EHEC :
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Contexte clinique pour la détection d’EHEC : (138)
En cas de SHU et PTT (et en cas de suspicion)
Chez l’enfant jusqu’à 6ans en cas d’hospitalisation pour diarrhée aigue ou chronique.
En cas de selles hémorragique et aqueuses.
En cas de colite hémorragique déterminée par endoscopie. En cas d’entérocolite nécrotique.
En cas d’anémie hémolytique ou d’insuffisance rénale aigue associées à une diarrhée au cours de la semaine passée.
En cas de contact avec des individus d’établissements publics, touchés par une diarrhée aqueuse, un SHU ou par une infection à EHEC dans les organisations municipales.
Apres un foyer infectieux dans la restauration collective.
La démarche du diagnostic :
-Le diagnostic microbiologique classique, repose sur l’isolement et l’identification des EHEC dans les selles des patients .Il est souvent limité à la recherche d’E. Coli O157:H7, qui possède des caractéristiques biochimiques (absence de fermentation du sorbitol en 24 heures, absence de beta-glucuronidase) à la base de nombreuses techniques de détection .Ainsi, le milieu le plus utilisé est la gélose MacConkey sorbitol. Des étapes d’enrichissement par culture, ou par capture à l’aide d’anticorps spécifiques dirigés contre l’antigène O157, ont été développées afin d’améliorer la sensibilité. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de détecter les souches O157:H7 atypiques (fermentant le sorbitol) ou les souches appartenant aux sérogroupes autres que O157. De plus, il est indispensable de confirmer le diagnostic par identification
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biochimique et par agglutination sur lame avec des sérums spécifiques anti-O et anti-H. (42)
-Le diagnostic, peut également être basé sur la détection des gènes codant les Shiga toxines et les facteurs d’adhésion, par hybridation sur colonies avec des sondes nucléiques spécifiques, ou par la technique d’amplification génique (PCR). Cette dernière méthode est rapide, sensible et spécifique, mais uniquement réalisée dans des centres de référence. Elle a pour avantage de permettre la détection des souches possédant les gènes stx, indépendamment de leur sérotype ou de leurs propriétés biochimiques.
-La mise en évidence des toxines dans les selles, par recherche de l’activité sur cellules Véro est un test sensible et spécifique, mais laborieux et coûteux. (51) Enfin, le diagnostic peut être confirmé par la sérologie, qui recherche la présence d’anticorps anti-lipopolysaccharides spécifiques de 26 sérogroupes d’E. Coli (58).La figure 28 représente les étapes du diagnostic des infections humaines à EHEC.
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Figure 28. Étapes du diagnostic des infections humaines à EHEC (117)
1) Diagnostic d’E. Coli O157:H7:isolement et identification : • Prélèvements :(130)
On prélève les matières fécales du patient, ou on effectue un écouvillonnage rectal.
En raison de l’élimination rapide de ce pathovar du tube digestif, au cours d’un SHU, leur concentration dans les selles décroit très rapidement entre le début des prodromes digestifs et le moment du SHU (<10²/g de selles) .Donc, le recueil des selles doit s'effectuer au moins 6 jours après le début des signes de colite hémorragique, puis être analysés immédiatement.
~ 84 ~ • Sécurité
Les échantillons, pouvant contenir des EHEC, devront être manipulés avec précaution, sachant que la quantité de bactéries capable d’entraîner de graves infections chez l’homme peut être très faible (de l’ordre de100 unités formant colonies) (151) et que des infections sont déjà survenues au laboratoire (voir chapitre épidémiologie)
a) Mise en Culture directe des Escherichia coli O157 : (121) (126)
E. coli O157:H7 fermente rapidement le lactose et ne se distingue pas de la
plupart des autres E. coli dans des milieux traditionnels contenant du lactose (exemple : le BCP). Mais pratiquement, toutes les souches d’E. Coli O157:H7 ne fermentent pas le D-sorbitol en 24 heures et ne possèdent pas de beta glucuronidase. A l’inverse d’environ 95 % des souches d’E. Coli d'origine humaine, qui fermentent le sorbitol en 24 heures et sont glucuronidase positive.
Cette incapacité dans laquelle se trouvent les EHEC, de ne pas fermenter rapidement le D-sorbitol et le fait qu’elles soient dépourvues de béta-glucuronidase, est exploitée pour les isoler et les identifier.
La gélose MacConkey (SMAC) qui contient 1 % de D-sorbitol a été mise
au point, pour profiter de cette caractéristique en remplaçant le lactose par du sorbitol .C’est actuellement le milieu le plus utilisé et le meilleur pour isoler E.
coli O157, où elles se développent sous forme de petites colonies incolores
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Figure 29. Colonies d’Escherichia coli O157:H7sur Gélose de MacCONKEY-Sorbitol après incubation de 24 heures / 37°C (128)
Caractéristiques :
E. coli O157:H7 : colonies lisses, incolores, pouvant présenter un halo orangé d’alcalinisation. Les colonies sont légèrement colorées de façon artificielle par l’absorption des colorants présents dans la formulation du milieu.
E. coli non-O157:H7 : colonies rouges, de taille nettement supérieure.
-La sélectivité de ce milieu ,est encore améliorée par l’addition de 0,05 mg/litre de céfixime (CR-SMAC),et de 2,5 mg/litre de tellurite de potassium (CT-SMAC).Le résultat, étant un effet inhibiteur plus marqué sur les E. coli non-O157 et sur les autres bactéries qui ne fermentent pas le sorbitol, tels que les genres Aeromonas, Plesiomonas, Morganella et Providencia (117)
Les milieux chromogéniques ou contenant des glucuronides
Fluorogéniques , sont utilisés pour distinguer les E. coli O157:H7 ne produisant pas de béta-glucuronidase des E. coli qui en produisent :
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L’hydrolyse du 4-méthylumbelliferyl-D-glucuronide (MUG) par la béta-glucuronidase, entraîne la formation d’un composé fluorescent visible en lumière ultra-violette. L’addition de 0,1 g/litre de 5-bromo-4-chloro-3-indoxylbéta-D-glucuronide (BCIG) au SMAC, permet de différencier les colonies incolores d’E. Coli O157:H7 des colonies bleu-vertes des bactéries ne fermentant pas le sorbitol mais possédant une béta-glucuronidase (146).
b) Identification et caractérisation des colonies suspectes:
Diagnostic d’orientation : le sérogroupage O
Les colonies sorbitol négatives (incolores), choisies sur une gélose SMAC doivent être ensuite testées, pour la recherche de l'antigène O157, par agglutinations sur lames de verre ou en tube .Ceci, en utilisant des sérums anti-LPS O ou des réactifs latex (latex avec anticorps O157 et latex témoin). Les isolats positifs agglutinant avec l'antisérum O157, doivent être envoyé à un laboratoire de référence pour la confirmation (138).
Diagnostic de certitude : La confirmation de E. coli O157 consiste en
l’identification biochimique, le test de détection de l’antigène H7 et le test de la toxine Shiga (pour confirmer la virulence) :
L’identification biochimique :
E. coli O157 :H7est un bacille à Gram négatif, appartenant à la famille des Enterobacteriaceæ et au genre Escherichia, et donc, a les mêmes caractères
biochimique que les autres E. coli .Pour son identification biochimique, on utilise des galeries d’identification classique des entérobactéries : Les EHEC sont oxydase négatifs, fermentent le lactose et le glucose (avec ou sans production de gaz), réduisent les nitrates en nitrites. Ils sont catalase positifs(1), avec l'exception toutefois du sorbitol et de l'activité b-glucuronidase. (121)
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Les Escherichia coli, peuvent être distingués des Escherichia hermanii, par le fait qu’elles ne se développent pas en présence de cyanure de potassium, et ne fermentent pas la cellobiose, à l’inverse des Escherichia hermanii qui produisent un pigment jaune caractéristique sur gélose nutritive. (146)
l’identification de l’antigène flagellaires « H » : (149)
L’antisérum O, est connu pour entraîner des réactions croisées vis-à-vis d’autres bactéries, dont E. hermanii, Salmonella O groupe N, Yersinia enterocolitica sérotype O9 et Citrobacter freundii. D’où, la nécessité de vérifier la présence de l’antigène flagellaire « H » dans les isolats (il existe des sérums anti-56 H). Mais il faut alors cultiver la bactérie sur gélose mobilité. Certaines bactéries pathogènes sont immobiles (négatives pour l’antigène H).Pour ces souches, la production de toxines Shiga devrait être recherchée.
Détection des Shiga toxines libres dans les selles: (146) (149) L’épreuve sur cellules Véro ou Hela, reste la méthode de référence pour confirmer la production de stx. Les membranes plasmatiques des cellules Véro, contiennent une grande quantité de globotriaosylcéramide (Gb3) et de globotétraosylcéramide (Gb4), qui sont les récepteurs sur lesquels se fixent les stx, et permettent de détecter tous les variants de ces toxines.
L’épreuve peut être réalisée sur des suspensions de matières fécales, des filtrats de cultures ou des cultures bactériennes vivantes.
Les colonies se développent en bouillon trypticase-soja, les cultures filtrées, sont ajoutées à la lignée cellulaire Véro. Ces dernières prennent une forme ronde et se détachent les unes des autres, en présence de stx (effet cytopathogène du aux
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vérotoxines). Une grande quantité des stx n'est pas libérée dans le milieu, mais reste liée à la bactérie .Donc, afin d’améliorer la sensibilité de l’épreuve, ces toxines peuvent être relarguée par traitement à la polymyxine B ou à la mytomycine.
Bien que sensible, cette épreuve n’est pas pratiquée en routine dans tous les laboratoires de diagnostic. Elle demande en effet beaucoup de travail et ses résultats ne peuvent être obtenus que 3 à 4 jours après l’inoculation des cellules. Faute de cultures cellulaires, d’autres épreuves immunologiques plus simples à mettre en œuvre, peuvent être utilisées pour détecter la production de stx, notamment l’ELISA ou l’agglutination.
c) Techniques de détection des EHEC ne nécessitant pas leur culture (détection des gènes stx):
En vue d’une identification rapide dans les prélèvements, des antigènes O et H ainsi que des stx , ou des gènes associés à sa production, de nombreuses
épreuves immunologiques ou basées sur l’hybridation des acides nucléiques
ont été développées. Afin d’améliorer la sensibilité de détection de ces bactéries, leur application doit être précédée par une étape d’enrichissement du prélèvement.
~ 89 ~ c.1) L’étape d’enrichissement :
c.1.1) Enrichissement par l’utilisation de Milieux d’enrichissement liquides: (150)
Les milieux de culture d’enrichissement liquides sont généralement constitués : -D’eau peptonée tamponnée ,additionnée de 8 mg/litre de vancomycine, de 10 mg/litre de céfsulodine et de 0,05 mg/litre de céfixime (BPW-VCC), afin d’inhiber la croissance des bactéries prenant la coloration de Gram, ainsi que celle d’Aeromonas spp et de Proteus spp.
-De bouillon modifié « trypticase-soy : mTSB » additionné de 20 mg/litre de novobiocine ou de 10 mg/litre d’acriflavine ,afin de réduire la croissance des bactéries prenant la coloration de Gram .
Les EHEC poussent mal à 44°C. Pour réduire au minimum la croissance exagérée des autres germes, l’incubation optimale est de 6 h à 37°C.
c.1.2) Séparation immunomagnétique :
La séparation immunomagnétique (IMS pour Immunomagnetic Separation) a été employée en tant que technique de concentration sélective, pour faciliter l’isolement des E. coli O157:H7, lorsqu’ils sont en nombre réduit. Des particules électromagnétiques disponibles dans le commerce, ou des billes recouvertes d’anticorps dirigés contre le lipopolysaccharide (LPS) de la bactérie d’E coli O157, sont mélangés avec l’échantillon à tester. (151)
Les billes sur lesquelles se sont fixées les bactéries, sont séparées du surnageant sous l’action d’un champ magnétique et, après lavage, sont ensemencées sur une gélose sélective qui est incubée 18 h à 37°C ,pour isoler les colonies suspectes.
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La technique est spécifique du sérogroupe. Il existe dans le commerce des systèmes permettant une séparation manuelle ou automatique (152).
c.2) Méthodes d’analyse :
Méthodes immunologiques utilisant des anticorps dirigés contre l'antigène O157 :
Parmi les diverses épreuves immuno-enzymatiques, c’est l’ELISA sandwich qui est le plus couramment utilisé.
Dans ce test, l’anticorps polyclonale anti-O157 est utilisé comme anticorps de capture, de façon à capturer l’antigène O157; après ajout d’un substrat approprié, un second anticorps monoclonal couplé à une enzyme (marqué à la peroxydase), se fixe à cet antigène et le colore. (149)
Les trousses de diagnostic correspondantes, ont été validées avec des protocoles de pré-enrichissement et des réactifs capables d’assurer des résultats reproductibles. Certains travaillent avec des échantillons chauffés, pour améliorer leur sécurité, ou automatisent l’analyse pour pouvoir traiter un grand nombre d’échantillons. D’autres trousses, comme les « blot ELISAs », ont été mises au point, pour repérer les colonies dans lesquelles se trouve l’antigène O157. Les trousses du commerce, ont l’avantage d’être facilement utilisées par un laboratoire non spécialisé, et les épreuves doivent être réalisées en suivant les instructions du fabricant. (146)
Méthodes de reconnaissance des acides nucléiques (méthodes moléculaires) pour la mise en évidence des gènes de virulence :
C’est les méthodes les plus sensibles pour détecter les différents gènes de virulence. Soit par hybridation sur colonies à1' aide de sondes nucléiques
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spécifiques, soit par amplification génique (PCR) sur les colonies suspectes, ou directement sur les selles.
Compte-tenu de la présence en très faible quantité des EHEC dans les selles, 1'amplification génique in situ par PCR des gènes codant pour Stx et Stx2 dans les selles, représente une méthode très sensible (153)
i) Épreuves d’hybridation des colonies(146)
A partir des isolements bactériens, l’hybridation sur colonies est recommandée pour le repérage des colonies suspectes.
Il existe des sondes ADN et des sondes d’oligonucléotides de synthèse marquées à la digoxigénine ou à la biotine, et donc utilisables dans des laboratoires non spécialisés.
Il existe aussi des épreuves, permettant de détecter les gènes stx, le plasmide de 60 MDa d’E. Coli O157 et les gènes eae (Soit individuellement, soit tous ensemble). Les épreuves d’hybridation sont moins sensibles lorsqu’il s’agit de détecter les EHEC, dans des bouillons de culture ou des matières fécales.
ii) PCR pour les gènes stx et autres marqueurs de virulence :
De nombreuses techniques d’amplification génique PCR ont été publiées, permettant de détecter et de typer les gènes stx, eae et leurs variants (154). Ces « PCR » utilisent des amorces oligonucléotidiques ciblées ,sur des séquences conservées des gènes eae, stx1, stx2.Le tableau 6 (126) représente une sélection des systèmes les plus fréquemment mis en œuvre pour ce pathovar (les amorces sont sélectionnés dans les zones conservés).
Les PCR (polymérase Chain Reaction) sont habituellement réalisées sur des souches isolées au cours de la coproculture.Mais en raison de la faible concentration fécale des EHEC, l’amplification génique directement sur les
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selles est préconisée .Un enrichissement des selles sur 3 heures en eau peptonée est conseillé avant la PCR. (126)
Pour ces diagnostics directs, plusieurs techniques sont nécessaires pour isoler les bactéries ou extraire leur ADN (chromatographie sur sépharose et adsorption des acides nucléiques sur résines) pour éviter les inhibiteurs de la polymérase contenus dans les selles (138).
Tableau 6. Systèmes d’amplification génique les plus fréquemment mis en œuvre (126)
EHEC : Escherichia coli entérohémorragique PCR : polymerase chain reaction
Stx : shiga toxines
Eae : protéine eae (E. coli attaching and effacing)
De nombreuses épreuves multiplexes ont été mises au point, pour détecter simultanément plusieurs gènes (PCR multiplexes couplées à une identification des amplicons par une hybridation à l'aide d'oligonucléotides spécifiques des variants du facteur recherché), Les problèmes posés par la variabilité des gènes ,sont le plus souvent résolus par le choix d'amorces à partir de zones conservées,
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sélectionnées après alignements des séquences des variants. Le tableau 7 décrit l'une des dernières PCR multiplex publiées (155) pour diagnostiquer EHEC.
Tableau7. Dernière PCR multiplex mise au point pour les principaux pathovars et pathovars intermédiaires. (155)
Stx : genes codant les shiga toxines
Esc: gène codant pour la protéine esc (E. coli secretion)
STEC LEE : Escherichia coli producteurs de shiga toxines possedant le locus d’effacement des entérocytes
bp :paire de base
Des sondes ADN et des tests de PCR ,ont été aussi développées pour détecter d’autres gènes reconnus comme virulents chez l’homme, notamment le gène
fliC (codant le flagelle H7, pour caractériser les souches NM), le gène rfb
(codant l’une des enzymes de la biosynthèse du LPS O157) et le gène uidA (gène mutant de la glucuronidase des E. coli O157:H7 ne produisant pas de béta-glucuronidase) (126).
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d) Epreuves sérologiques : détection des anticorps anti-LPS (153) (117)
Chez l’homme, le sérodiagnostic d’E. Coli O157 et des autres sérogroupes est intéressant, particulièrement en phase tardive de la maladie lorsque l’agent causal devient de plus en plus difficile à isoler dans les fèces.
Dans la majorité des infections à EHEC, les malades développent, dans les 7 à 10 jours, des anticorps (IgG, IgM et IgA) anti-lipopolysaccharides (LPS) qui sont détectables à un titre souvent très élevé, même plusieurs semaines après le début des symptômes.
Le diagnostic sérologique doit être réalisé sur un sérum « précoce » et un sérum « tardif » (le plus souvent 2 à 3 semaines après le premier), afin de rechercher une augmentation du titre des anticorps attestant l'infection.
Cependant, un titre élevé, même sur un seul sérum, peut parfois être un indicateur fiable d'une infection récente à E. coli O157 .Actuellement, la détection des anticorps LPS du sérogroupe O157, mais aussi d'autres sérogroupes (026, O91, O103, O111, O128, et O145), peut être réalisée par différentes techniques: ELISA, hemagglutination qui détectent IgM, IgA et IgG.
2) Diagnostic d’E. Coli atypiques (non-O157:H7):isolement et identification a)culture des EHEC non-O157 (146)
Les EHEC non-O157, poussent bien sur des milieux permettant la croissance de
E. coli, tels que la gélose au sang ou la gélose MacConkey. La majorité d’entre
elles ne peuvent se distinguer des autres E. coli que par leur pouvoir de production de stx.
Les souches O26, étant incapables de fermenter le rhamnose, des milieux ont été récemment développés pour distinguer les E. coli 026 du reste de la flore intestinale :
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la gélose MacConkey rhamnosée (rhamnose-MacConkey agar : RMAC) dans laquelle le lactose est remplacé par 10 g/litre de rhamnose. L’addition de 2,5 mg/litre de tellurite de potassium et de 0,05 mg/litre de céfixime (CT-RMAC) améliore la sélectivité de ce milieu.
La gélose rhamnosée chromogénique incorporant 10 g/litre de rhamnose et 0,02 g/litre de rouge phénol ,à une gélose Esculine agar pour coliformes (un milieu indicateur de la présence de béta-galactosidase), à laquelle sont ajoutés 0,5 mg/litre de tellurite de potassium et 0,05 mg/litre de céfixime. Sur ce milieu, les colonies O26 apparaissent bleues sombre à noires, les autres sérotypes de E.
coli sont verts et les entérobactéries autres qu’E. Coli sont vertes, jaunes ou
incolores.
Un outil marqueur de virulence des EHEC est la production
d’entérohémolysine, qui provoque l’hémolyse des hématies de mouton lavées,
après incubation durant une nuit sur gélose au sang additionnée de calcium. Cette production caractéristique d’hémolysine est retrouvée dans 90 % des E.
coli producteurs de stx isolés lors d’infections humaines. Toutefois, on s’est
aperçu qu’un certain nombre d’EHEC pathogènes pouvaient ne pas produire d’entérohémolysine, ce qui réduit l’intérêt d’utiliser la gélose précédemment décrite pour trier les souches d’EHEC.
Lorsqu’une hémolyse est observée, la mise en évidence des gènes codant pour les Shiga-toxines est indispensable (par PCR).
b) Isolement et identification des EHEC non-O157 :
Dans la plupart des cas, l’isolement des EHEC est réalisé en repérant directement sur la gélose, les colonies productrices de stx par immunoblot ou par séquençage de l’ADN, afin de mieux les caractériser.
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Ces colonies sont d’abord repiquées, de façon à pouvoir disposer d’un double après avoir analysé la colonie originale. A partir de ces colonies, soit un
immunoblot est réalisé sur des membranes appropriées (en nitrocellulose ou en
nylon) permettant leur réplication, soit les colonies sont prélevées et déposées dans des plaques de microtitrage à 96 trous, contenant du bouillon de culture pour répliquer les colonies avant d’en transférer des aliquotes sur des filtres appropriés. Les colonies sont alors analysées à l’aide de sondes nucléiques ou d’anticorps (L’usage d’anticorps monoclonaux évitera l’inconvénient des faux résultats positifs, observés avec les anticorps polyclonaux) de façon à identifier tous les EHEC (156).
Hull et ses collaborateurs (157) ont mis au point une épreuve par immunoblot à
la mytomycine, qui permet de mettre en évidence les EHEC dans les fèces suffisamment facile, pour qu’elle soit utilisable en routine.
L’épreuve immunoblot a l’avantage d’être plus simple à réaliser que celle des sondes ADN. Mais ces deux méthodes sont très laborieuses.Donc, il vaut mieux n’y recourir, qu’après avoir repéré les prélèvements dans lesquels les stx, ou les gènes stx, ont été mis en évidence par la technique ELISA ou par PCR.
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