Diagnostic direct

Outre la microscopie électronique, de nombreuses techniques ont été développées pour détecter les rotavirus directement dans les selles : ce sont soit des techniques conventionnelles, d’utilisation simple et rapide et permettant de détecter les antigènes viraux, soit des techniques de biologie moléculaire, très spécialisées, mais très sensibles, permettant de détecter l’ARN viral et, le cas échéant, de le caractériser.

2.1. 1.Microscopie électronique

Dans le cas de rotavirus, la microscopie électronique est la technique de référence. En effet, la visualisation de la morphologie caractéristique des particules virales en forme de rouepermet de faire le diagnostic avec une spécificité de 100 %. Cette méthode possède une sensibilité de 80 % à 90 % et permet de visualiser le virus directement dans le prélèvement après fixation rapide (quelques minutes) à l’acide phosphotungstique. Le principal avantage de la microscopie électronique est de pouvoir détecter tous les rotavirus humains (c’est-à-dire les groupes A, B et C), sans toutefois pouvoir les différencier, et de facilement les distinguer d’autres virus responsables de gastroentérite. En revanche, sa mise en œuvre nécessite un matériel coûteux et du personnel hautement qualifié, principales limites de son utilisation en routine dans un laboratoire. L’immunoélectromicroscopie (IEM) offre les mêmes avantages que la microscopie électronique en permettant d’observer les virus en faible quantité, mais

2.1.2-Techniques conventionnelles

Les techniques de détection des antigènes de rotavirus directement dans les selles sont de loin les plus utilisées en pratique courante et, à l’exception des techniques latex, concordent avec les techniques de biologie moléculaire dans près de 94 % des cas [130].Ces techniques ont pour point commun l’utilisation d’anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine de groupe VP6etspécifiquesdesrotavirusdugroupeA.

2.1.2.1-Tests d’agglutination latex

Les tests d’agglutination de particules de latex sont des tests unitaires rapides (quelques minutes). L’antigène présent dans le prélèvement provoque l’agglutination des particules de latex recouvertes d’anticorps anti-VP6. La sensibilité et la spécificité de ces tests sont nettement en retrait par rapport à celles des tests immunoenzymatiques et immunochromatographiques. Ces tests ne sont plus aujourd’hui recommandés pour le diagnostic virologique des gastroentérites à rotavirus.

2.1.2.2. Tests immunoenzymatiques

Les tests Elisa sont des tests immunoenzymatiques (EIA) sur microplaque permettant la détection des rotavirus du groupe A en 90 minutes environ. Le test se réalise à partir d’une dilution de selles à 10 % dans un tampon dédié. Ces tests ont une excellente sensibilité et spécificité (généralement de 95 %). Leurs avantages reposent sur une mesure objective de la densité optique de la réaction antigène-anticorps et la possibilité d’automatiser la technique pour un grand nombre d’échantillons. Les tests Elisa restent cependant Moinspraticables en dehors de la routine. (figure 20)

Figure 20: Déroulement de Méthodes immuno-enzymatiques ou ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [132].

(1) La plaque est recouverte avec un anticorps decapture.

(2) L'échantillon est ajouté, et tout antigène présent se lie à l'anticorps decapture. (3) L'anticorps de détection est ajouté, et se lie àl'antigène.

(4) L'anticorps secondaire lié à l'enzyme est ajouté, et se lie à l'anticorps dedétection.

2.1.2.3. Tests immunochromatographiques

Les tests immunochromatographiques (ICT) se présentent sous forme de test unitaire et permettent de recevoir dans un compartiment « échantillon », deux gouttes d’une solution de selles diluées. L’échantillon migre alors le long de la membrane et une bande apparaît au niveau des anticorps spécifiques de l’antigène viral détecté. Leur sensibilité est similaire à celle des tests immunoenzymatiques (environ 95 %) (Tableau IV), mais leur interprétation reste subjective [133]. Ces tests sont disponibles sous conditionnement unitaire et présentent l’avantage d’être faciles et rapides (10 à 15 minutes), ne nécessitant donc pas de personnel qualifié. Leur utilisation est particulièrement adaptée au coup par coup, aux situations d’urgence ou au lit du malade.

Tableau IV: Principales caractéristiques, de la praticabilité, et de la comparaison de la sensibilité et de la spécificité en référence aux résultats de la détection des rotavirus du groupe A par Elisa (enzyme-linked immuno sorbent assay) de sept trousses commerciales

d’immunochromatographie et du test d’agglutination latex [133].

Matériel nécessaire Facilité de lecture Virus détectés Spécificité

(100 selles rotavirus A négatives)

Sensibilité

(80 selles rotavirus positives) % [IC95%] Indéterminés(%)a % [IC95%] Indéterminés(%)a

Combo Rota/Adeno® T–P + RV, AdV 100[96,4-100] 0 87,5 [78,2-93,8] 1,2

Diarlex® MB avec centrifugation

V–T–P centrifugeuse

++ RV, AdV 100[96,4-100] 0 88,8 [79,7-94,7] 0,0

Diarlex® MB avec filtration Aucun + b RV, AdV 100 c [96,3-100] 31 70,0 [58,7-79,7] 12,5

Rota/Adeno® Combi-Stick V + RV, AdV 100[96,4-100] 0 82,5 [72,4-90,0] 0,0

Rotascreen® V–T ++ RV 100[96,4-100] 0 95,0 [87,7-98,6] 0,0

Rota-Strip® V–T–P ++ RV 100[96,4-100] 0 98,8 [93,2-99,9] 0,0

Vikia® Rota/Adeno Aucun +++ RV, AdV 100[96,4-100] 0 92,5 [84,4-97,2] 0,0

Slidex® Rota/Adeno V–T–P centrifugeuse

++ RV, AdV 100[96,4-100] 0 77,5 [66,8-86,0] 5,0

T : tube pour analyse ; V : flacon pour dilution ; P : pipettes et embouts ; RV : rotavirus ; AdV : adénovirus.

2.1.2.4-Limites des techniques conventionnelles

Ces techniques, bien que globalement sensibles et spécifiques, comportent quelques limites qui interfèrent sur les résultats de l’analyse en mettant en défaut la capacité des anticorps à fixer les antigènes présents dans l’échantillon. En effet, des particules virales en très faible quantité dans l’échantillon ou par le cycle de congélation-décongélation des selles – qui affecte l’échantillon en dégradant ou en gênant la réactivité des antigènes – peuvent être responsables de faux négatifs. Ces paramètres doivent être pris en compte lors de l’utilisation de ces tests, tout spécialement en cas d’analyses rétrospectives ou différées. Inversement, des cas de faux positifs peuvent être observés et dépendent essentiellement des caractéristiques de la technique utilisée.

2.1. 3 Techniques de biologie moléculaire

Les techniques de biologie moléculaire sont utilisées essentiellement en épidémiologie pour caractériser les souches virales et recourent en général à des techniques d’hybridation moléculaire.

2.1.3.1 Techniques historiques

L’électrophorégramme est l’étude du profil de migration de l’ARN viral marqué à l’argent sur gel de polyacrylamide permet- tant de distinguer les souches de rotavirus (électrophorétype). Cette technique simple à mettre en œuvre et économique a été globalement abandonnée dans les pays développés au profit des techniques d’amplification génique.

L’hybridation in situ est une technique de dépistage de rotavirus fondée sur l’hybridation entre des transcrits ARN simple brin de rotavirus marqués et l’ARN des

rotavirus de l’échantillon dénaturé par la chaleur et immobilisé sur une membrane de

nitrocellulose.

2.1.3.2 Amplification génique et génotypage

Parmi la variété de techniques disponibles, la technique d’amplification génique par transcription inverse ou RT-PCR est de loin la plus utilisée. Cette méthode de détection est plus sensible que l’électrophorétype et l’hybridation in situ 134. Outre le diagnostic

virologique par la détection du génome viral directement dans les selles, elle offre la possibilité de déterminer les génotypes G et P de rotavirus par couplage avec le séquençage. L’ARN viral est extrait à partir d’une suspension à 20 % de selles dans un tampon approprié. La transcription inverse des ARN viraux extraits est réalisée à l’aide d’hexamères aléatoires (randomhexamers)[135]et les ADN complémentaires produits sont utilisés pour les PCR de typage permettant l’amplification spécifique des génotypes G1 à G4, G8 à G10 et P[4], P[6], P[8] à P[11]. Les génotypes G sont globalement superposables aux sérotypes, mais pas le genotypes P.

2.1.4Autres techniques

D’autres techniques ont été développées telles que la détec- tion de rotavirus en cytométrie en flux ou en culture cellulaire, mais elles n’offrent pas les mêmes avantages que les techniques conventionnelles ou de biologie moléculaire.