DIAGNOSTIC DE CERTITUDE

VII.2.1. Diagnostic bactériologique

Les arguments cliniques, radiologiques et anatomo-pathologiques ne sont pas spécifiques de la tuberculose et ne peuvent donc permettre qu’un diagnostic présomptif. C’est la mise en évidence de bacilles de la tuberculose dans les produits pathologiques qui constitue le diagnostic définitif. De plus, le suivi bactériologique d’un patient mis sous antituberculeux est indispensable pour confirmer la stérilisation des lésions.

VII.2.1.1. Prélèvement des produits pathologiques

Dans la tuberculose pulmonaire, on pratique des prélèvements des sécrétions bronchiques (crachats, tubage gastrique, aspiration bronchique). Dans la tuberculose extra-pulmonaire, les prélèvements proviennent de foyers ouverts (urines), ou de foyers fermés (pus de ponctions et biopsies de plèvre, méninges, ganglions…).

23

VII.2.1.2. Examen microscopique

Pour mettre en évidence les mycobactéries à l’examen microscopique, on utilise leur propriété d’acido-alcoolo-résistance après les avoir colorées à la fuschine (coloration de Ziehl-Neelsen) ou avec un fluorochrome (coloration à l’auramine).

L’examen microscopique met donc en évidence des bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) sans faire la distinction entre bacilles de la tuberculose et mycobactéries atypiques. Il est peu sensible car il n’est positif que lorsque la concentration bacillaire est au moins égale à 10⁴/ml.

Malgré ces faiblesses, il est essentiel car il permet de détecter les malades les plus contagieux et de prendre rapidement (en quelques heures) les mesures de prévention adéquates pour l’entourage [200].

VII.2.1.3. Culture

Lorsque l’examen microscopique est négatif, le clinicien est amené à attendre les résultats de la culture pour confirmer le diagnostic (les techniques moléculaires restant, à ce jour, peu efficaces dans ces conditions).

La culture est beaucoup plus sensible que l’examen microscopique (seulement la moitié des cas de tuberculoses pulmonaires et une proportion moins importante encore des cas extrapulmonaires documentés sont positifs à l’examen microscopique et ne sont donc diagnostiqués que par la culture).

En raison de la croissance lente des mycobactéries il est indispensable d’attendre au minimum une, mais le plus souvent plusieurs semaines, pour obtenir le résultat. Sur milieu solide de Löwenstein-Jensen, les colonies de bacilles de la tuberculose (complexe

M. tuberculosis) sont détectées en moyenne en 21 à 28 jours, en 15 jours si le prélèvement est

très riche en bacilles (examen microscopique positif) mais parfois en 42 jours ou plus si le prélèvement est paucibacillaire (examen microscopique négatif). Avec les milieux de culture liquide (milieu MGIT [Mycobacterial Growth Indicator Tube] utilisé manuellement ou au sein de l’automate Bactec 960, milieu Bact/Alert MP de l’automate BacT/Alert3D, milieu MB Redox), la détection de la multiplication bactérienne se fait plus rapidement, en moyenne en 8

24

à 14 jours pour le complexe M. tuberculosis selon que les prélèvements sont à examen microscopique positif ou négatif [200].

La culture permet de faire l’identification des mycobactéries isolées et de procéder à la mesure de la sensibilité aux antibiotiques.

VII.2.1.4. Identification

L’identification des mycobactéries obtenues en culture repose habituellement sur l’étude des caractères culturaux et biochimiques qui est longue (le plus souvent plusieurs semaines) et fastidieuse.

On remplace maintenant, lorsqu’on en a les moyens, ces épreuves par l’hybridation avec des sondes complémentaires de séquences génomiques spécifiques.

Depuis une quinzaine d’années, avec les sondes Accuprobe® (Gen Probe), complémentaires de fragment d’ARN, on peut identifier les cultures du complexe

M. tuberculosis et de quelques mycobactéries atypiques (complexe M. avium, M. gordonae et M. kansasii), en moins de 2 heures. Leur sensibilité et leur spécificité, proches de 100%, font

de ces sondes un outil très fiable pour l’identification des bacilles de la tuberculose [109]. Aujourd’hui d’autres systèmes, qui nécessitent une amplification de l’ADN avant l’hybridation, permettent d’identifier en plus des mycobactéries citées ci-dessus, les autres espèces de mycobactéries atypiques les plus fréquemment rencontrées au laboratoire d’analyses médicales avec la même fiabilité. Ce sont les bandelettes INNO LiPA MYCOBACTERIA^® (Innogenetics) dont la cible est l’espace 16S-23S de l’ARNr et Genotype Mycobacterium^® (Hain Science) dont la cible est l’ARNr 23S [174, 198]. Comme les sondes Accuprobe^®, elles ne permettent pas d’identifier les espèces au sein du complexe

M. tuberculosis. Pour ce faire, on peut utiliser la bandelette Genotype MTBC^® (Hain Science) basée sur une PCR multiplex dont les cibles sont le gène de l’ARN 23S (pour M. tuberculosis

complex), la région RD1 (pour M. bovis) et le gène gyrB (pour M. africanum, M. tuberculosis

25

VII.2.1.5. Détection direct de M.tuberculosis par amplification génique

Les tests d’amplification génique ont pour finalité d’augmenter le nombre de copies d’un segment cible d’acide nucléique de manière à permettre sa détection. Ce sont des tests puissants dont le seuil théorique de sensibilité est d’une molécule d’ADN (ou d’ARN). Ce sont en plus des tests rapides car ils s’affranchissent du temps de multiplication des bacilles et ne reposent que sur des réactions enzymatiques. Appliqués au diagnostic de la tuberculose, ils permettent donc théoriquement de détecter rapidement la présence de bacilles du complexe

M.tuberculosis dans les prélèvements en cas d’examen microscopique négatif et par

conséquent de pallier à la lenteur de la culture.

La première technique d’amplification employée, une réaction simple de polymérisation en chaîne (PCR) de la séquence d’insertion IS6110 avec détection du fragment amplifié sur gel d’agarose, a été remplacée par des techniques standardisées utilisant des réactifs prêts à l’emploi : amplification par PCR d’une séquence d’ADN codant pour l’ARN 16S des mycobactéries (Amplicor Mycobacterium Tuberculosis Test^®, Roche), amplification d’une séquence d’ARN ribosomal via un intermédiaire ADN (Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test^®, Gen Probe, Bio Mérieux) ou amplification par déplacement de brin (BD Probe Tec^®, Becton-Dickinson) [200].

Avec ces méthodes les résultats sont obtenus rapidement (potentiellement en 24 heures si les tests sont mis en œuvre tous les jours) mais, dans la routine, les tests d’amplification génique se sont malheureusement révélés moins performants que la culture [208] : la sensibilité, qui est de 95- 100% lorsque les tests sont appliqués aux prélèvements riches en BAAR (à examen microscopique positif), tombe à 50-70% lorsqu’ils sont appliqués aux prélèvements pauvres en BAAR (examen microscopique négatif). La spécificité est, en routine, de l’ordre de 97%. La répartition inhomogène des bacilles dans les prélèvements est probablement une cause importante du manque de sensibilité et la contamination, la source majeure des faux positifs.

Les tests d’amplification génique sont donc recommandés pour distinguer les bacilles de la tuberculose des mycobactéries atypiques dans les prélèvements à examen microscopique positif, ce qui est intéressant pour les malades profondément immunodéprimés (sida, etc.) ou

26

pour les malades ayant des infections respiratoires chroniques pour lesquels la probabilité d’avoir une mycobactériose est élevée [25, 204].

VII.2.2. Diagnostic sérologique

Des nouveaux tests basés sur la mesure de l’interféron-γ (IFN-γ) ont été développés récemment. Ils sont basés sur le fait que les lymphocytes T d’un individu infecté par

M. tuberculosis relarguent l’IFN-γ lorsqu’ils sont mis en contact avec des antigènes

mycobactériens [97,129]. Un relargage élevé d’IFN-γ indique une sensibilisation des lymphocytes à M.tuberculosis mais ne peut faire la distinction entre infection tuberculeuse latente et tuberculose maladie, tout comme IDR à la tuberculine [60,169]. Un point crucial est le choix des antigènes mycobactériens qui déterminent la spécificité du test. Pour les tests actuellement disponibles, il s’agit des antigènes ESAT-6 (« early secretory antigenic target 6») et CFP-10 (« culture filtrate protein 10 ») qui se trouvent dans une région génomique de

M.tuberculosis appelée RD1 (pour « région de différence »1) [20,77]. RD1 est absente chez les souches de M.bovis BCG et de la plupart des mycobactéries non tuberculeuses à l’exception notable de Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum et Mycobacterium szulgai [161]. Les tests sérologiques actuellement commercialisés sont d’interprétation incertaine : leur emploi n’est pas recommandé en l’état actuel malgré leur intérêt.

VII.2.3. Autres

La technique ELISPOT permet de refléter l’activité de la tuberculose et le contrôle de l’infection sous traitement. Les tests biochimiques directs et indirects pourraient apporter des perspectives intéressantes mais n’ont pas été validés.

27

VIII. DEFINITIONS DE CAS