Prélèvements Examen direct Cultures Détection antigénique Sang Sabouraud+ATB (Incubation à 37°C) Recherche de galactomannane/ technique ELISA Coloration Sérum LBA
Figure25: Démarche diagnostique de l’API chez la patiente
Bouillon d’enrichissement
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1. Prélèvements
La patiente a bénéficié des prélèvements suivants:
Nature des prélèvements Conditionnement Analyses effectuées
Sang (Quatre
prélèvements successifs à raison de deux tubes par prélèvement)
Sur tube EDTA Premier tube: Centrifugation et
culture de la couche
leucocytaire sur milieu de Sabouraud–chloramphénicol Deuxième tube: Centrifugation et ensemencement de la couche leucocytaire sur bouillon
d’enrichissement puis
repiquage, après 48h, sur milieu de Sabouraud–chloramphénicol
Sérum (Deux
prélèvements successifs)
Tube sec Antigénémie aspergillaire
LBA Flacon stérile Examen direct et culture sur
milieu
Sabouraud-chloramphénicol
Tableau 7: Les prélèvements réalisés chez la patiente-au Laboratoire de Parasitologie & de Mycologie Médicale -HER-
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Des conditions strictes d’asepsie sont recommandées au laboratoire, pour ne pas contaminer les prélèvements par des spores environnementales.
2. Diagnostic mycologique
La patiente a bénéficié d’un examen mycologique complet avec un examen direct et des cultures sur milieu Sabouraud.
a. Examen direct
L’examen direct était réalisé en mettant quelques gouttes de LBA entre lame et lamelle. L’observation microscopique est effectuée à l’objectif 10 puis 40.
Il est considéré positif en cas de présence de spores ou de filaments mycéliens ou têtes aspergillaires.
b. Cultures
La culture est une étape indispensable pour l’identification du genre et de l’espèce.
Le milieu de culture utilisé doit fournir les éléments indispensables à la croissance de l’Aspergillus. Le milieu adopté pour cette étude est le milieu de Sabouraud gélosé. Il est additionné de chloramphénicol afin d’éviter la contamination bactérienne. Ce milieu préalablement stérilisé à 120°C pendant 20 min.
Les prélèvements sanguins étaient traités de la façon suivante: après centrifugation, la couche leucocytaire a été ensemencée sur plusieurs milieux Sabouraud -chloramphénicol pour le premier tube, le deuxième est ensemencé sur un milieu liquide d’enrichissement appelé milieu cœur-cervelle ou Brain
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Heart (BH). Après 48 heures, ce bouillon d’enrichissement est repiqué sur plusieurs milieux Sabouraud-chloramphénicol puis mis à l’étuve à 37°C. Des lectures régulières on été réalisées dans les 15 jours ayant suivi les prélèvements avant de conclure à un résultat négatif.
Les prélèvements LBA étaient, aussi, ensemencés sur milieu Sabouraud– chloramphénicol et mis à l’étuve à 37°C.
En se basant sur l’aspect macroscopique et microscopique on identifie l’espèce responsable de l’infection.
Identification macroscopique est basée sur l’étude de : - L’aspect ;
- La couleur ; - Le relief, etc.
Identification microscopique :
On prélève une ou plusieurs parties de la culture et on passe à la lecture au microscope optique à l’objectif 10 pour visualiser le meilleur champ de lecture et déterminer la longueur des hyphes, et à l’objectif 40 qui permet de préciser les éléments d’identification et déduire l’espèce fongique. Parfois, nous étions obligés de passer à l’immersion pour plus de détails.
Les caractères importants à identifier au microscope sont le conidiophore et la morphologie de la tête aspergillaire.
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3. Diagnostic immunologique
Donne des résultats plus précoces que les techniques mycologiques (examen direct et cultures).
L’antigénémie aspergillaire repose sur l’identification dans le sérum d’un antigène aspergillaire circulant: galactomannane «GM» qui est un constituant, polysaccharidique important de la paroi du champignon. Il est très immunogène, thermostable et résiste à l'action des protéases. Ces caractéristiques permettent sa détection par un test immunologique après traitement protéolytique ou thermique. Ce traitement permet de libérer le galactomannane des immunocomplexes et de réduire les faux positifs. Il présente le désavantage d’être rapidement éliminé de la circulation par le fois et le rein, conduisant alors à une concentration sérique basse, pouvant tomber sous le seuil de détection.
La recherche de cet antigène aspergillaire est effectuée sur sérum en utilisant la technique immunoenzymatique ELISA dont le principe est basé sur l’utilisation d’un anticorps monoclonal dirigé contre le galactomannane (Platelia Aspergillus®).
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II. Résultats
L’ensemble des données cliniques, mycologiques et radiologiques est essentiel pour porter le diagnostic car Aspergillus étant ubiquitaire, sa mise en évidence dans des prélèvements même profonds, n’implique pas forcément sa responsabilité.
Le diagnostic d’API a été évoqué chez la patiente qui a présenté un syndrome hémorragique, infectieux et anémique après deux semaines de sa chimiothérapie. Elle a été mise sous antibiothérapie à large spectre mais l’évolution n’était pas favorable et la fièvre persistait et l’hémogramme a montré une neutropénie sévère (60 éléments/mm3)
La radiographie du thorax a montré un syndrome interstitiel. Sur le plan clinique, la patiente a présenté une toux hémoptysique avec des douleurs thoraciques.
La recherche mycologique sur les quatre prélèvements sanguins (sur tube EDTA) a révélé la présence des filaments mycéliens dichotomiques à angle aigu en faveur d’Aspergillus au niveau du bouillon d’enrichissement BH du troisième prélèvement (figure 26).
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La culture sur milieu de Sabouraud-chloramphénicol de la couche leucocytaire des prélèvements sanguins sur EDTA identifie l’espèce Aspergillus
flavus.
Figure 26: Filaments mycéliens dichotomiques à angle aigu isolés au niveau de bouillon d’enrichissement BH. Photo prise au Laboratoire de
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Figure 27: A. flavus sur milieu Sabouraud-chloramphénicol. Photos prises au Laboratoire de Parasitologie & de Mycologie Médicale -HER-. (A) recto:
surface poudreuse, irrégulière, granuleuse et de couleur verte. (B) revers: incolore à blanc rosé.
B A
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L’examen direct du lavage broncho-alvéolaire (LBA) a mis en évidence des têtes aspergillaires (figure 28). Par contre les cultures de LBA sont revenues négatives.
La recherche des antigènes aspergillaires sur deux sérums par technique ELISA double sandwich (Platelia Aspergillus®) était positive.
Figure 28: Tête aspergillaire isolée au niveau du LBA. Photo prise au Laboratoire de Parasitologie & de Mycologie Médicale -HER-.
73 Sérum Recherche des galactomannanes. Q
Résultats
Examen mycologique Examen immunologique Examen radiologique Bouillon d’enrichissement Culture Examen direct Culture Positif Positive Positive Négative Positive LBA Sang Hémogramme Syndrome interstitiel Neutropénie sévèreFigure 29: Résultats obtenus par le Laboratoire de Parasitologie & de Mycologie Médicale –HER-
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