Szenker Emmanuelle, Lacoste Nicolas and Almouzni Geneviève Cell Reports, Juin 2012, Volume 1, numéro 6, pages 730–740,
DOI : 10.1016/j.celrep.2012.05.006
Résumé des résultats principaux :
Afin d’étudier les rôles respectifs d’H3.2 et H3.3 au cours du développement embryonnaire, nous avons exploité la technique d’injection d’oligonucléotides morpholinos, découverte en 2000 (Heasman et al., 2000; Heasman, 2002). Cette technique est particulièrement puissante pour interférer avec la fonction de nombreux facteurs et est très bien documentée chez le Xénope. Le principe de cette méthode s'appuie sur la reconnaissance spécifique de séquences d'ARN messagers (en général au niveau du codon intiateur), pour interférer avec la progression du complexe d’initiation et empêcher la traduction du transcrit ciblé. Pour cela, des molécules synthétiques appelées morpholinos et permettant une interaction stable avec les ARNm cibles ont été élaborées. Ces molécules possèdent environ 25 bases azotées classiques, fixées sur des cycles morpholines au lieu de désoxyribose qui sont liées entre eux par des groupements phosphorodiamidates non chargés au lieu de groupements phosphates. Ces différentes caractéristiques donnent aux morpholinos une très grande stabilité et les rendent insensibles aux nucléases. Ils fournissent donc un moyen commode pour inactiver l’expression d’une protéine cible et étudier comment cette inactivation influence le développement dans une étape particulière, qu'il est ensuite possible d'analyser au niveau mécanistique en la replaçant dans le contexte des cascades d'inductions développementales.
Dans cette étude, nous avons donc utilisé deux morpholinos distincts dont nous avons vérifié la spécificité après injections dans des embryons (Figure 1A). Ainsi, un morpholino (MO H3) cible à la fois H3.2 et H3.3 tandis que l’autre morpholino (MO H3.3) cible spécifiquement H3.3 (voir Figure S2A pour la spécificité des anticorps). L’étude de
début de la gastrulation (Figure 1B), tandis qu’affecter spécifiquement H3.3 conduit à des défauts au cours de la gastrulation, en particulier au moment de la fermeture du blastopore, conduisant à des embryons non viables (Figure 1B). De façon remarquable, ces défauts peuvent être sauvés par une surexpression d’ARNm H3.3 alors que l’ARNm H3.2 ne permet pas de contrecarrer l’action du morpholino H3.3 (Figure 2). Ainsi, nous pouvons conclure qu’H3.3 est nécessaire, au moment de la gastrulation, pour assurer une fonction dont ne peut s’acquitter le variant canonique H3.2.
Pour replacer l’origine des défauts observés en dérégulant le niveau d’expression d’H3.3 dans le contexte des mécanismes d’induction mésodermique au moment du processus de gastrulation, nous avons exploité le marqueur précoce du mésoderme, Xbra (Smith et al., 1991). Ainsi, par hybridation in situ, nous observons que la baisse d’expression d’H3.3 conduit à un défaut très marqué dans l’expression d’Xbra tout au long du processus de gastrulation (Figure 3A). Ce résultat a également pu être confirmé par qRT-PCR (Figure 3B). Ainsi, la baisse du niveau d’H3.3 affecte clairement l’expression du marqueur mésodermique Xbra, ce qui explique en partie les défauts de gastrulation observés. De plus, une analyse par qRT-PCR d’une trentaine de gènes impliqués dans l’identité cellulaire de l’endoderme, mésoderme, neuroectoderme ou de l’épiderme a permis de mettre en évidence que les gènes affectés en absence d’H3.3 régulent principalement la différenciation du mésoderme en aval de Xbra (Figure 3B) ou encore le neuroectoderme (Figure S4A).
Afin d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine des défauts observés au cours de la gastrulation, nous avons souhaité tester la capacité de réponse aux signaux mésodermiques (qui sont responsables de l’induction de l’expression de Xbra comme nous l’avons vu dans l’introduction) des embryons déplétés pour H3.3, en particulier en ce qui concerne les mouvements morphogénétiques de convergence et d’extension. Cette étude a pu être réalisée grâce au test de la calotte animale (Green, 1999). Cette expérience consiste à prélever les cellules ectodermiques du pôle animal de l’embryon au stade blastula et de les mettre en culture avec l’activine, un inducteur de mésoderme de la famille des TGFβ (Smith et al., 1990). Dans une telle situation, la calotte animale d’un embryon sauvage est induite en mésoderme et suit des mouvements de convergence et d’extension visualisés par une élongation de la calotte. La baisse d’expression d’H3.3 ne semble pas affecter la réponse des calottes animales à l’activine (Figure 4A). Dans ces conditions, Xbra semble alors suffisamment exprimé pour induire l’élongation des calottes. Ce résultat peut être mis en relation avec le fait que les embryons traités avec le morpholino H3.3 sont affectés à la fin du processus de gastrulation. Ces résultats peuvent suggérer un rôle d’H3.3 non pas dans l’induction mais dans le maintien de l’expression de Xbra dans le
viabilité cellulaire ex vivo (calottes animales, Figure 4A) et in vivo au cours du développement embryonnaire (Figure 4B et C).
Afin de déterminer si l’effet d’interférence avec H3.3 peut être assigné à son incorporation par une voie d’assemblage spécifique, nous avons ciblé des facteurs clefs tel que son chaperon HIRA. De façon très intéressante, nous observons un phénotype comparable à celui obtenu en ciblant H3.3 (Figure 5A et B). De plus, ces défauts de gastrulation se traduisent également par un défaut d’expression de Xbra (Figure 5C). De façon remarquable, nous avons pu montrer un lien direct entre les phénotypes HIRA et H3.3 car l’absence de HIRA conduit clairement à un défaut d’incorporation d’H3.3 dans la chromatine des embryons injectés (Figure 6B). De plus, des défauts d’expression de HIRA ou de H3.3 conduisent tous deux à une sensibilité plus importante de la chromatine à la MNase, une nucléase qui digère préférentiellement l’ADN non protégé par les nucléosomes (Figure 6C). L’ensemble de ces données montre l’importance de la voie d’incorporation de H3.3 via HIRA pour l’intégrité de la chromatine au cours du développement embryonnaire.
Ainsi, cette étude a permis de mettre en évidence que le variant d’histone H3.3 est essentiel au cours du développement embryonnaire vertébré et que sa voie d’assemblage via son chaperon HIRA est particulièrement critique au moment de la gastrulation à la fois pour l’expression de gènes clés et l’intégrité de la chromatine.
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Cell Reports