Jullien J*, Astrand C*, Szenker E, Garrett N, Almouzni G and Gurdon JB. * contribution équivalente
En révision à Epigenetics & Chromatin
Introduction – La reprogrammation transcriptionnelle par transfert nucléaire Le succès du clonage animal par transfert nucléaire (NT) dans un œuf énucléé, établi chez le Xénope par John Gurdon (Gurdon, 1962), montre que le noyau d’une cellule somatique adulte différenciée peut retourner à un état de type embryonnaire, lui permettant de repasser par les étapes de développement qui conduisent à la formation d’un animal normal. L’obtention de ces animaux illustre la plasticité extraordinaire du noyau et l’influence de son environnement cytoplasmique sur le profil d’expression des gènes. Ainsi, les mécanismes moléculaires sous-jacents de cette reprogrammation transcriptionnelle font l’objet de nombreuses études, notamment pour comprendre les modifications des marques épigénétiques et les remaniements de structure chromatinienne impliqués dans cette étape (Gurdon, 1976; Pasque et al., 2011c). L’œuf et l’ovocyte de Xénope représentent un système idéal pour étudier ce processus in vivo. Alors que le transfert nucléaire dans des œufs de Xénope permet notamment l’étude des mécanismes induisant l’activation de la réplication des noyaux transférés (Graham et al., 1966), le transfert nucléaire dans des ovocytes arrêtés en prophase I de méiose facilite l’étude de la reprogrammation au niveau transcriptionnel. En effet, l’injection de noyaux différenciés dans le noyau d’un ovocyte (vésicule germinative d’environ 400µm de diamètre), conduit à la réactivation des gènes de pluripotence (De Robertis and Gurdon, 1977). Ce système de transplantation nucléaire dans les vésicules germinatives d’ovocytes de Xénope (Halley-Stott et al., 2010) paraît donc idéal pour étudier les mécanismes sous-jacents au remaniement de la structure chromatinienne conduisant à la réactivation de gènes type embryonnaire. Notamment, le laboratoire de John
2010; Jullien et al., 2010). Ces données suggèrent que la liaison de l’histone B4 dans la chromatine est un événement crucial pour la reprogrammation des noyaux somatiques transplantés dans les ovocytes. Ceci pourrait s’expliquer par une chromatine plus permissive, plus « ouverte », comme retrouvée dans les cellules souches embryonnaires mammifères (pour revue voir (Meshorer and Misteli, 2006)). A l’opposé, le variant d’histone macroH2A inhibe la reprogrammation transcriptionnelle (Pasque et al., 2011a). L’ensemble de ces données nous a donc incité à étudier l’éventuelle importance du variant d’histone H3.3 dans ce processus, sachant que H3.3 est généralement associé avec l’euchromatine (Ahmad and Henikoff, 2002b). De plus, dans un système de transfert nucléaire dans des œufs de Xénope, H3.3 participe au maintien de l’état actif d’un gène de façon épigénétique (Ng and Gurdon, 2008; Lacoste and Almouzni, 2008).
Résultats principaux (voir manuscrit en annexe)
Afin d’étudier l’importance des variants non centromériques de l’histone H3, notamment H3.2 et H3.3, dans le processus de reprogrammation transcriptionnelle par le cytoplasme ovocytaire après transfert nucléaire (NT), une première étape importante était de connaître la proportion de ces deux types de variants dans les ovocytes. J’ai donc réalisé une expérience d’extraction de vésicules germinatives (GV), contenant le stock protéique majeur en histones des ovocytes (Adamson and Woodland, 1974; 1977). L’analyse des extraits de GV sur gel Triton Acetic acid Urea (TAU) permettant la séparation des variants d’histones (Zweidler, 1978) m’a permis de mettre en évidence que les ovocytes présentent un stock deux fois plus important en histone H3.3 par rapport à H3.2. La situation s’équilibre dans les œufs et s’inverse dans les embryons tardifs jusqu’à un ratio équivalent à ce qui est retrouvé dans les cellules somatiques (Figure 54, Figure1A du manuscrit). Ces résultats mettent en avant l’importance d’H3.3 dans les ovocytes, des cellules différenciées non cyclantes, et suggèrent qu’un grand nombre de molécules d’ARNm codant pour H3.2 est traduit au moment de la maturation ovocytaire.
Afin d’étudier l’incorporation éventuelle des différents variants d’histones d’origine ovocytaire dans la chromatine des noyaux transférés, des versions étiquetées GFP de H3.2 et H3.3 ont été injectées dans les ovocytes avant la procédure de transfert nucléaire. L’étude par western blot des extraits totaux de tels ovocytes m’a permis de montrer que l’injection de 2ng ou 3ng d’ARNm permet d’obtenir des protéines étiquetées d’une quantité comparable aux protéines endogènes pour H3.3 (Figure 55, Figure S1 du manuscrit). La même quantité d’ARNm codant pour H3.2 est injectée et devrait donc représenter une plus grande proportion des protéines H3.2 totales d’après le résultat du gel TAU (Figure 54).
Ces contrôles importants ont permis l’étude de l’incorporation de ces variants d’histones d’origine ovocytaire dans la chromatine de noyaux de cellules ES transférés dans les vésicules germinatives. Une telle expérience a permis de mettre en évidence qu’une fraction significative des histones H3 (H3.2 et H3.3) de la chromatine des noyaux transplantés est fortement remplacée par le variant H3.3 d’origine ovocytaire, en comparaison à H3.2 (voir Figure 1 du manuscrit en annexe). Cette incorporation massive d’H3.3 suite au transfert nucléaire pourrait contribuer au changement du paysage chromatinien permettant la reprogrammation transcriptionnelle.
Pour étudier la reprogrammation transcriptionnelle, une lignée de cellules ES contenant environ 20 copies de la région régulatrice du gène Oct4 fusionnée à un gène rapporteur a été établie (ESC#5). De façon importante, l’inactivation du gène Oct4, et la différenciation de ces cellules, peut être induite par traitement à l’acide rétinoïque (RA-ESC#5). Le transfert nucléaire de telles cellules différenciées est notamment suivi par la réactivation d’un gène rapporteur sous l’influence des régions régulatrices du gène Oct4. L’injection d’ARNm H3.2 ou H3.3 étiquetés HA dans le cytoplasme ovocytaire avant transfert nucléaire (voir également Figure 55) a permis de mettre en évidence par des expériences de ChIP que cette réactivation corrèle avec un enrichissement d’H3.3 par rapport à H3.2 dans cette région. De plus, l’incorporation d’H3.3 semble être un événement très précoce après transfert nucléaire, permettant d’émettre l’hypothèse selon laquelle l’incorporation d’H3.3 permettrait la réactivation transcriptionnelle (Figure 2 du manuscrit).
Enfin, il était important de déterminer si cette incorporation d’H3.3 était liée à la voie d’assemblage dépendant du chaperon d’histone HIRA. Pour cette étude, l’anticorps dirigé contre xHIRA établi dans notre laboratoire, a pu être utilisé pour immunodépléter HIRA (Ray-Gallet et al., 2002). En effet, ceci a été démontré dans des extraits d’œufs de Xénope mais il était important de vérifier l’effet de cet anticorps lors de l’injection dans des ovocytes. J’ai donc réalisé un test d’assemblage de la chromatine (Roche et al., 2006) grâce à la co-injection d’ADN plasmidique et de sérum contrôle ou anti-xHIRA. J’ai ainsi pu montrer que l’injection d’un sérum anti-HIRA conduit à des défauts d’assemblage du plasmide en chromatine de façon indépendante de la synthèse d’ADN (Figure 56, Figure S4 du manuscrit). Ces données permettent de confirmer l’approche de déplétion de HIRA par injection de sérum anti-HIRA dans les ovocytes.
Ainsi, l’étude de transfert nucléaire dans de tels ovocytes a permis de mettre en évidence que la déplétion de HIRA interfère avec l’incorporation d’H3.3. Ainsi, l’incorporation d’H3.3 suite au transfert nucléaire est dépendante de son chaperon HIRA. De façon remarquable, la déplétion de HIRA semble permettre une incorporation alternative de H3.2 (Figure 3 du manuscrit). Connaître le mécanisme permettant cette incorporation alternative
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réparation de l’ADN, est une question qui devra être adressée dans le futur.
L’ensemble de ces données a permis de mettre en évidence l’importance de la voie d’assemblage de H3.3 de façon dépendante de HIRA pour la reprogrammation transcriptionnelle de noyaux différenciés après transfert dans des ovocytes.
Ma contribution
En plus des expériences présentées ci-dessous qui constituent des contrôles importants pour cette étude, j’ai eu un regard critique sur toutes les figures et ai activement participé à la relecture du manuscrit.