Description technique de la maison ERE 132

Das 100 amostras, 82 (82%) foram positivas na RIFI, com títulos iguais ou superiores a 40, a saber: 9 cães (11%) com título 40; 13 (15,85%) 80; 17 (20,73%) 160; 16 (19,51%) 320; 17 (20,73%) 640; 6 (7,3%) 1280; 1 (1,22%) 2560; 2 (2,44%) 5120 e 1 (1,22%) apresentou título de 10.240 (Figura 8).

FIGURA 8 Distribuição dos títulos de anticorpos anti-Leishmania spp pela RIFI

dos cães de Bauru. Botucatu, 2008.

Quando são correlacionados os animais positivos na RIFI com o exame parasitológico direto, é possível estabelecer que dos 9 cães que apresentaram título mínimo de 40, em apenas dois (22,22%) detectou-se formas amastigotas no material de punção de linfonodo. No caso do título 80, 8 (61,54%) apresentaram parasitismo nos linfonodos. No título 160, 8 (47,06%) foram positivos; para 320, 14 (87,5%); para 640, apenas 6 (35,3%); para 1280, 4 (66,66%), para 2560, nenhum deles; para 5120, um animal (50%) e para 10.240 nenhum animal foi positivo no exame parasitológico direto (Tabela 12).

Quando são comparados os títulos da RIFI com os resultados do ELISA, dos nove animais com título 40, seis (66,66%) foram reagentes no ELISA; 13

com título 80, 12 (92,30%) reagiram no ELISA; 17 com título 160, todos (100%) reagiram no ELISA; 16 com título 320, 15 (93,75%) foram positivos no ELISA; 17 com título 640, 16 (94,12%) também foram positivos no ELISA; dos seis que apresentaram título 1.280, (100%) foram reagentes; apenas um cão apresentou título 2560, também positivo no ELISA (100%); dois cães com título 5.120 sendo ambos também positivos no ELISA, da mesma forma que o animal com título 10.240 (Tabela 13).

TABELA 12 Distribuição dos títulos sorológicos obtidos na RIFI, comparado

com os resultados dos exames parasitológicos diretos, a partir da punção de linfonodos dos cães de Bauru. Botucatu 2008.

Títulos na RIFI Parasitológico positivo Parasitológico negativo TOTAL 40 2 (22,22%) 7 (77,88%) 9 (10,98%) 80 8 (61,54%) 5 (38,46%) 13 (15,85%) 160 8 (47,06%) 9 (52,94%) 17 (20,73%) 320 14 (87,5%) 2 (12,5%) 16 (19,51%) 640 6 (35,3%) 11 (64,7%) 17 (20,73%) 1280 5 (83,33%) 1 (16,67%) 6 (7,32%) 2560 0 (0%) 1 (100%) 1 (1,22%) 5120 1 1 2 (2,44%) 10240 0 1 1 (1,22%) TOTAL 44 38 82 (100%)

Esses resultados sugerem que quanto maior o título na RIFI, maior a chance da amostra ser positiva também na prova de ELISA, ou seja, maior é a concordância entre as provas, fato compreensível já que ambas detectam a mesma classe de anticorpos.

TABELA 13 Distribuição dos animais de Bauru de acordo com os títulos de

anticorpos apresentados na RIFI, e sua correlação com os resultados do ELISA. Botucatu 2008.

5.12 ELISA

Como o presente estudo, outro trabalho obteve também uma pequena parcela de reações inespecíficas no ELISA. A prova foi comparada à RIFI utilizando 149 soros de cães infectados com L. infantum e 75 controles negativos, de animais que viviam em área não endêmica e 11 cães não infectados apresentando outras enfermidades. No ELISA, 137 (91,9%) dos animais infectados foram positivos enquanto que na RIFI 147 (98,7%) foram positivos. Os cães controles foram todos negativos à RIFI enquanto que 1 (14%) foi positivo no ELISA. Não foram observadas reações cruzadas na RIFI. O ensaio imunoenzimático apresentou elevada sensibilidade (91,9%) e alto valor preditivo (92,6%), mesmo apresentando especificidade menor que a RIFI. Comparada à RIFI, o ELISA oferece inúmeras vantagens técnicas: é rápido e necessita de quantidades mínimas de antígeno, anticorpos conjugados e cromógenos, e o procedimento diagnóstico leva aproximadamente o mesmo tempo exigido pela RIFI. A sensibilidade do ELISA foi de 100% em cães que apresentaram títulos maiores ou iguais a 320 e apresentou falsos negativos quando os títulos na RIFI foram menores. Esses cães normalmente são

Títulos na RIFI RIFI positiva ELISA positivo % concordância

40 9 6 92,30% 80 13 12 92,30% 160 17 17 100% 320 16 15 93,75% 640 17 16 94,12% 1280 6 6 100% 2560 1 1 100% 5120 2 2 100% 10240 1 1 100%

assintomáticos ou estão em fases inicias da doença, tornando a prova inadequada para detectar fases subclínicas da doença (MANCIANTI et al., 1996). O uso de proteínas do parasito purificadas, no desenvolvimento de novos testes de ELISA são úteis para aumentar a sensibilidade e particularmente a especificidade da prova, como foi demonstrado por Rosário (2002).

O teste de ELISA apresenta algumas desvantagens produzindo resultados falsos negativos, como nos soros de cães assintomáticos ou aqueles que estão em fase inicial da doença, pois o título de anticorpos está muito baixo não é detectado. No entanto, o teste possui grande potencial para ser usado a campo, pois é facilmente aplicável, pode ser interpretado visualmente, todos os passos são conduzidos em temperatura ambiente e os seus reagentes são estáveis por um longo período de tempo (MANCIANTI et al., 1996).

Durante inquéritos epidemiológicos, a RIFI em particular, e outros testes sorológicos, como o ELISA, podem subestimar a prevalência e a incidência dificultando assim, os métodos de controle. O surgimento dos anticorpos demora um período variável, após o estabelecimento da infecção, entretanto, tornam-se distintamente elevados após o desenvolvimento dos sinais clínicos ou a partir do momento em que é possível o isolamento do parasito. Além disso, uma parcela significativa da população nunca desenvolve altos títulos em resposta à infecção e não se torna clinicamente doente ou transmite o parasito. Caso houvesse uma boa correlação entre títulos de anticorpos e infectividade, a eliminação seletiva de cães removeria de maneira efetiva os animais responsáveis pela transmissão (DYE et al., 1993).

Estudo comparativo entre os testes de ELISA e RIFI revelou que de 30 amostras de soro de animais com resultados positivos em cultura, o ELISA detectou 27 amostras positivas e a RIFI apenas 12, o que mostra a possibilidade de falhas na RIFI na detecção de cães infectados. Discute-se a sua implicação no controle da doença em áreas endêmicas, pois a detecção apenas parcial dos casos caninos em determinada região resulta na permanência de cães infectados contribuindo para a manutenção do ciclo de transmissão. Comparativamente à RIFI, o ELISA é um procedimento mais rápido e simples, necessita de apenas uma diluição de soro e é considerado mais sensível (CABRAL et al., 1998).

A realização da RIFI e ELISA com antígeno proveniente de extrato bruto de leishmania, revelou para a RIFI sensibilidade de 83% e especificidade de 100% e para o ELISA a sensibilidade e especificidade foi de 94 e 90%, respectivamente. Houve correlação positiva entre elas, com P<0,05) (ALMEIDA et al., 2005).

Avaliando-se a RIFI, ELISA rK39 e ELISA com antígeno bruto de L. chagasi, Pedras et al. (2008) obtiveram 89,8% de sensibilidade para o ELISA com antígeno bruto, 88,6% para ELISA recombinante e 92% para a RIFI. Da mesma forma que no presente estudo, a sensibilidade foi maior para a RIFI. A especificidade das provas foram de 81% para o ELISA com antígeno bruto, 92,4% para ELISA recombinante e 83,8% para RIFI. As reações cruzadas, que reduziram as especifidades da RIFI e ELISA bruto ocorreram principalmente nas amostras de pacientes humanos com doença de Chagas. A especificidade também é menor no ELISA em comparação à RIFI. O ELISA é altamente sensível, entretanto, sua especificidade é variável de acordo com o antígeno utilizado. O antígeno mais comumente empregado é o antígeno bruto solúvel extraído de formas promastigotas, com 80-100% de especificidade, de acordo com Sundar e Rai (2002).

5.13 PCR

O exame de PCR apresentou alta especificidade e sensibilidade (100 e 91,11%). Dos 100 animais utilizados, 77 foram positivos e 23 negativos. Dos 77 positivos, em 36 (46,75%) não se detectou formas amastigotas no parasitológico direto. Pode-se inferir, desta forma, considerando-se 100% de especificidade, que o método parasitológico não detecta muitos cães infectados, que podem apresentar parasitismo nos linfonodos, porém, de intensidade que os olhos do examinador não são capazes de detectar. Reale et al. (1999), processaram amostras de aspirados de linfonodos pela microscopia direta e a PCR, com sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivo e negativo de 100%. 40% dos animais sem lesões e 38% dos com sinais clínicos, apresentaram resultados falso negativos na RIFI. Esses cães contribuem sobremaneira para a disseminação da infecção entre os cães, e representam risco potencial para saúde pública.

Os cães com resultados positivos na PCR-LIN foram testados novamente com os primers RV1 e RV2. Como trata-se de região endêmica também para leishmaniose cutânea, esse procedimento foi adotado para que se pudesse confirmar que os linfonodos estavam realmente parasitados por Leishmania chagasi, já que o primeiro par de primers utilizado identifica qualquer espécie de Leishmania. Apenas um cão apresentou resultado negativo com os primers RV1 e RV2. Esse cão foi negativo também nas outras provas, sugerindo que provavelmente estivesse infectado por alguma espécie tegumentar. Este não apresentou também reação cruzada, nas provas sorológicas.

Apesar do presente estudo sugerir a infecção de linfonodo por uma espécie tegumentar, Madeira et al. (2006) relataram no Rio de Janeiro, o primeiro caso de co-infecção por L. braziliensis e L. chagasi, enfatizando a importância da identificação das espécies envolvidas nas áreas endêmicas, e a necessidade de rever os métodos para o controle epidemiológico. Foram utilizados primers específicos para cada espécie e não se detectou infecção mista na lesão cutânea, baço ou linfonodo, sugerindo que as duas espécies apresentam um tropismo específico, mesmo na co-infecção. É essencial utilizar várias amostras de diferentes órgãos em cães com lesões cutâneas.

Ocorreu a dispersão da L. chagasi em áreas que antes eram endêmicas somente para L. braziliensis, tornando o método específico da PCR interessante por discriminar as espécies envolvidas, além de ser rápido, sensível, não necessitar de cultura dos parasitos, adequando-se principalmente para o controle epidemiológico da doença que necessita de resultados laboratoriais rápidos e eficientes (GOMES et al., 2006).

Desta forma, utilizou-se no presente estudo, PCR com os primers RV1 e RV2 para que pudessem ser confirmadas as infecções pela espécie viscerotrópica L. chagasi, entretanto nos cães que foram positivos em ambas as provas, não se eliminou a possibilidade de co-infecção com ambas as espécies. A LT é relatada na região de Bauru desde o início da construção da estrada de ferro Noroeste, quando apareceram úlceras na pele de muitos trabalhadores. Desde então, a LT foi denominada de “úlcera de Bauru” e a região passou a ser reconhecidamente endêmica para a enfermidade (COSTA, 1992). Assim como em Bauru, Belo Horizonte também é uma região de ocorrência concomitante de L. chagasi e L. braziliensis, fato que torna

importante a confirmação da LV (ANDRADE et al., 2006). Os cães com leishmaniose cutânea, podem apresentar-se positivos em provas sorológicas, sendo a PCR espécie-específica importante. Pacientes humanos infectados por L. chagasi mostraram-se positivos quando foram utilizados antígenos de L. braziliensis e T. cruzi pela imunofluorescência, comprovando a presença de determinantes antigênicos comuns às enfermidades, explicando as reações sorológicas cruzadas (VEXENAT et al., 1996).

Reações cruzadas com títulos baixos para a doença de Chagas e a leishmaniose tegumentar americana podem ocorrer. Nos casos de LV normalmente os títulos são elevados, geralmente superiores a 80, sendo que os títulos inferiores necessitam de confirmação por outros métodos (ALVES e BEVILLAQUA, 2004). Apesar desse aspecto, o cão do presente estudo que foi positivo na PCR gênero-específica, a despeito de negativo na PCR espécie- específica, foi também negativo nas provas sorológicas. Provavelmente, este animal estava infectado por alguma espécie de leishmania tegumentar.

A PCR pode falhar em alguns casos. Avaliaram-se 95 culturas de aspirados de linfonodos e PCR das mesmas amostras, sendo 69 negativas e 23 amostras positivas em ambas as provas. Nenhuma amostra negativa na cultura foi positiva na PCR, todavia, três delas foram positivas na cultura e negativas na PCR (MAIA et al., in press). Esses resultados são semelhantes aos obtidos na presente pesquisa, pois quatro cães apresentaram formas amastigotas no parasitológico direto e foram negativos na PCR.

Para validar a PCR no diagnóstico da leishmaniose em cães, amostras de medula óssea de 25 animais positivos na cultura ou inoculação em hamsters foram utilizadas, comparando-se com amostras de 35 cães não infectados provenientes de área não endêmica dos Estados Unidos. Os primers 13A e 13B amplificaram a região conservada do minicírculo, redundando em um produto de 118 pares de bases dos 25 cães controle positivos, sendo capaz de detectar a partir de um organismo, com sensibilidade de 100%. Os 35 animais utilizados como controle negativos foram negativos na PCR, com especificidade de 100%.

A baixa sensibilidade do exame parasitológico direto, a ineficiência do exame sorológico em detectar infecção ativa e casos curados (HU et al, 2000) é um problema no diagnóstico, que pode ser solucionado pela aplicação da PCR. A alta sensibilidade e especificidade, a habilidade em detectar e identificar o

protozoário envolvido, o fato de poder ser aplicada diretamente em amostras clínicas e produzir resultados confiáveis em poucas horas são vantagens em relação a outras técnicas tradicionais (IKONOMOPOULOS et al, 2003).

Ikonomopoulos et al. (2003), testaram amostras de vários tecidos e soros de cães suspeitos para LV utilizando RIFI, PCR e exame parasitológico direto. A comparação dos resultados obtidos pela RIFI e PCR de amostras de sangue, apresentou 91,8% de concordância. A discrepância foi maior nas amostras positivas na RIFI, que pode ser atribuída à persistência de anticorpos mesmo após a eliminação do parasito. Por outro lado, a imunodeficiência de alguns animais e a incapacidade de produzir quantidades suficientes de anticorpos, pode ser a causa de resultados positivos na PCR e RIFI negativa. A diferença entre os resultados da RIFI e PCR pode ser atribuída também a falhas no momento da coleta das amostras, muito comuns nas punções de linfonodos e medula óssea, e por fim, pelo fato dos parasitos distribuírem-se não uniformemente no organismo. Ainda no mesmo estudo, a comparação dos resultados obtidos no exame parasitológico direto de aspirados de linfonodos com a PCR, indica que, como esperado, a PCR é mais sensível, pois 14 de 34 amostras (41%) das consideradas negativas no exame parasitológico, foram positivas na PCR, sendo que 12 delas (35,2%) também foram positivas na RIFI. Esses últimos resultados podem ser atribuídos ao baixo limite de detecção do exame parasitológico direto ou talvez à interpretação errônea (IKONOMOPOULOS et al., 2003).

A sensibilidade e especificidade das provas sorológicas variam consideravelmente, e podem subestimar a incidência da doença. Métodos baseados na PCR para detecção de leishmanias, podem promover o padrão- ouro para determinar a presença e identificação das leishmanioses não somente em casos ativos, mas também para monitoração de cura parasitológica de pacientes após quimioterapia, e como uma ferramenta para a detecção de infecção em hospedeiros vertebrados e nos vetores (SINGH e SIVAKUMAR, 1997).

FIGURA 9 Gel de eletroforese, apresentando bandas de 145 pares de base

amplificadas pelos primers RV1 e RV2. Sendo, C+ o controle positivo de promastigotas de L. chagasi provenientes de meio de cultura; C- amostra de aspirado de linfonodo controle negativo de cão proveniente de área não- endêmica; H2O: água livre de nucleotídeos para controle dos reagentes; Ladder: marcador de peso molecular (PM) de 100 pares de base.

FIGURA 10 Gel de eletroforese apresentando as bandas de 720 pares de bases

amplificadas pelos primers LIN R4 e LIN 19. Sendo: PM o marcador de peso molecular de 100 pares de bases; C+ controle positivo proveniente de promastigotas de L. chagasi de meios de cultura; 1 amostra positiva, 2 controle negativo proveniente de amostra de linfonodo de cão de área não-endêmica; 3 amostra positiva; 4 amostra positiva; 5 amostra positiva; H2O água para controle dos reagentes; 6 amostra positiva cm grande quantidade de DNA; 7 amostra negativa.