CHAPITRE 3. MÉTHODE EXPÉRIMENTALE
3.6 Développement de la méthode d'extraction
Pour le développement de la méthode d’extraction, l’eau de la rivière Magog a été utilisée. Elle a été échantillonnée le 7 mai 2015, aux coordonnées géographiques suivantes : 45o16'14,4"N, 72o07'15,3"W. Trente échantillons ponctuels d’eau de surface ont été échantillonnés à environ 30 cm de profondeur, à 5 mètres du bord de la rivière. Les prélèvements ont été effectués dans un cercle d’environ 2 mètres de diamètre. Des bouteilles en polyéthylène haute densité ont été utilisées. Les échantillons ont été gardés à -80oC jusqu'à 12 heures avant la journée de l'extraction.
Pour optimiser la méthode d'extraction et évaluer ses effets sur les résultats obtenus en analyse semi-ciblée, différentes cartouches d'extraction sur phase mobile ont été testées, soit une cartouche polymérique neutre (Strata-X) et deux combinaisons de cartouches cationiques et anioniques, faibles (Strata-X-AW, Strata-X-CW) et fortes (Strata-X-A, Strata-X-C).
Dans le but de comparer les différentes cartouches utilisées, les rendements d'extractions ont été évalués pour chaque composé modèle à une concentration de 200 pg/ml dans la matrice. Cette concentration est représentative des concentrations des contaminants dans les eaux de surfaces énumérés dans les revues de la littérature, chapitre 1.
Ainsi 100µL d'une solution à 500 ng/ml (H2O/MeOH 1:1) de chaque composé est ajoutée à trois échantillons de 250 ml d'eau de rivière. Un quatrième échantillon, servant de référence, est extrait, et l'ajout de composés est fait après l'extraction. Le pH de l’eau de rivière est ajusté avec HCl 1N jusqu'à l’obtention d’un pH de 2,5 ou 6,5, dépendamment de la cartouche utilisée. Pour la cartouche neutre, les deux pH ont été testés et le pH donnant les meilleurs rendements d’extraction a été sélectionné. Pour prévenir la formation de complexe organométallique avec les ions métalliques et les molécules organiques présentes en solution, 50 mg de l'agent complexant EDTA a été ajouté dans chaque échantillon pour obtenir une concentration finale de 0,2 mg/ml. Pour les cartouches ioniques, deux élutions ont été effectuées, soit une élution neutre avec un mélange de solvant sans additif et une élution ionique avec un solvant composé d’une base, soit le MeOH (5% NH4OH) ou d’un acide, soit le MeOH (5% A.F.). Cette stratégie a été sélectionnée dans le but de pouvoir briser les différentes interactions possibles avec la phase stationnaire de la cartouche. Les élutions pour les cartouches ioniques ont été recueillies dans deux tubes différents. Un blanc de la matrice a été extrait et analysé dans le but de ne s’assurer qu’aucun contaminant faisant partie des contaminants modèle sélectionnés, soit présent et puisse interférer dans les résultats obtenus. Lorsque des contaminants ont été détectés, l’intensité a été soustraite aux intensités des contaminants dans les échantillons dopés.
La première cartouche testée est la Strata-X, (200 mg/6 ml), de chez Phenomenex. Chaque cartouche a été conditionnée avec 5 mL ACN/MeOH (1:1) suivi de 5 mL d'eau à pH 6,5 ou pH 2,5. Par la suite, les échantillons ont été chargés à deux différents pH, soit 6,5 et 2,5, sous pression négative à un débit de 2-4 ml/min. Après le chargement, la cartouche a été lavée 2x avec 5 ml d'eau de qualité LC-MS (pH :6,5 et pH 2,5) et séchée sous pression réduite. L'élution a été faite avec 2 x 2,5 ml d'un mélange MeOH/ACN (50:50).
La deuxième cartouche testée est la Strata-X-AW, (200 mg/6ml), de chez Phenomenex. Chaque cartouche a été conditionnée avec 5 ml ACN/MeOH (50:50), suivi de 5 ml d'eau à pH 6,5. Par la suite, les échantillons ont été chargés, sous pression négative, à un débit de 2-4 ml
min à pH 6,5. Après le chargement, la cartouche a été lavée 2x avec 5 ml d'eau (25mM AmAc) et séchée sous pression réduite. L'élution a été faite avec 2x 2,5 ml d'un mélange MeOH/ACN (50:50) suivi de 2x 2,5 ml d'un mélange MeOH (5% NH4OH).
La troisième cartouche testée est la Strata-X-CW, (200 mg/6ml), de chez Phenomenex. Chaque cartouche a été conditionnée avec 5 ml ACN/MeOH (50:50) suivi de 5 ml d'eau à pH 6,5. Par la suite, les échantillons ont été chargés, sous pression négative, à un débit de 2-4 ml min à pH 6-5. Après le chargement, la cartouche a été lavée 2 x avec 5 ml d'eau (pH 6,5) et séchée sous pression réduite. L'élution a été faite avec 2x 2,5 ml d'un mélange MeOH/ACN (50:50) suivi de 2x 2,5 ml d'un mélange MeOH (5% A,F.).
La quatrième cartouche testée est la Strata-X-C, (200 mg/6ml), de chez Phenomenex. Chaque cartouche a été conditionnée avec 5 ml ACN/MeOH (50:50) suivi de 5 ml d'eau à pH 2,5 ou 6,5. Par la suite, les échantillons ont été chargés, sous pression négative, à un débit de 2-4 ml min à pH 2,5 ou 6,5. Après le chargement, la cartouche a été lavée 2 x avec 5 ml d'eau (pH 6,5) et séchée sous pression réduite. L'élution a été faite avec 2x 2,5 ml d'un mélange MeOH/ACN (50:50) suivi de 2x 2,5 ml d'un mélange MeOH (5% NH4OH.).
La cinquième cartouche testée est la Strata-X-A, (200 mg/6ml), de chez Phenomenex. Chaque cartouche a été conditionnée avec 5 ml ACN/MeOH (50 :50) suivi de 5 ml d'eau à pH 6,5. Par la suite, les échantillons ont été chargés, sous pression négative, à un débit de 2-4 ml min à pH 6,5. Après le chargement, la cartouche a été lavée 2 x avec 5 ml d'eau (25mM AmAc) et séchée sous pression réduite. L'élution a été faite avec 2x 2,5 ml d'un mélange MeOH/ACN (50:50) suivi de 2x 2,5 ml d'un mélange MeOH (5% A,F.).
Chaque échantillon a été évaporé sous courant d'azote dans le but de garder l’extrait obtenu intacte avant la reconstitution dans le solvant d’injection, à température ambiante. Le solvant de reconstitution choisi est un mélange H2O / MeOH (1:1). Ce mélange a été sélectionné dans le but de solubiliser une large gamme de composés de différentes polarités. Le volume de
reconstitution est de 300 μL. Ce volume permet d’atteindre un facteur de concentration de 833 et est le volume minimum requis pour solubiliser l’extrait obtenu pour effectuer l’injection.
Tableau 2. Résumé des conditions testées pour l’optimisation de la méthode d’extraction
Élution 2 x 5 mL ACN:MeOH (1:1)
A) 2 x 5 mL ACN:MeOH (1:1)
B) 2 x 5 mL 5% NH4OH dans MeOH (Strata-X-AW)
C) 2 x 2.5 mL 5% A.F. dans MeOH (Strata-X-CW)
A) 2 x 5 mL ACN:MeOH (1:1) B) 2 x 5 mL 5% NH4OH dans MeOH (Strata-X-AW)
C) 2 x 2.5 mL 5% A.F. dans MeOH (Strata-X-CW)
Reconstitution Évaporation N2, Reconstitution 300 µL (H2O: MeOH)(1:1)
Lavage 2 x 5 mL H2O (pH 6.5) 2 x 5mL H2O (pH 2,5) 2 x 5 mL H2O 25mM AmAc (strata-X-AW) 2 x 5 mL H2O pH 6,5 (strata-X-CW) 2 x 5 mL H2O 25mM AmAc (strata-X-A) 2 x 5 mL H2O pH 6,5 (strata-X-C) Étapes Strata-X Strata-X-CW, Strata-X-AW Strata-X-C Strata-X-A
Conditionnement
Chargement
A) 5 ml ACN/MeOH (1:1), B) 5 ml H2O pH 6.5, C) 5 ml H2O pH 2.5 (strata-X, strata-X-C)
pH: 6.5, 2 à 4 ml/min, pression négative