Analyse semi-ciblée

Le principe de l'analyse ciblée sans standard repose sur l'identification des molécules présentes dans un spectre de masse par association avec leur spectre de masse théorique appartenant à une base de données. L'analyse se fait en plusieurs étapes : l'analyse de l'échantillon, l'identification des molécules expérimentales et la comparaison des spectres de masse expérimentaux avec les spectres de masse théoriques. L’algorithme et les pointages de corrélation définis dans le texte suivant sont les paramètres utilisés pour la méthode d’analyse de ce mémoire. La description est tirée du logiciel Data Analysis version 4,2, de Brucker Daltonics.

L'échantillon contenant les analités est purifié en laboratoire par diverses méthodes d’extraction, avant d'être injecté sur un système chromatographique et être analysé par un spectromètre de masse à haute résolution. Toutes les molécules présentes, pouvant être ionisées par la source et ayant un ratio masse sur charge dans la gamme des ratios sélectionnés par le quadripôle sont enregistrées.

Les masses analysées sont traitées et enregistrées par un algorithme nommé molecular

Feature. Ce dernier est basé sur le principe que chaque isotope d'un composé atteint le

détecteur dans un petit intervalle de temps. De plus, chaque isotope d'une même molécule sera séparé par un intervalle de masse fixe. Par exemple, une molécule possédant une charge de +1 aura un intervalle d’approximativement 1 Da entre ses isotopes. Ainsi l'algorithme considère qu'une série de signaux appartient à un composé, lorsqu’une haute corrélation est obtenue entre l'intervalle de temps de détection des signaux et leur intervalle de masse.

Lorsque les spectres de masse expérimentaux ont été définis, les spectres de masse théoriques sont comparés aux spectres de masse expérimentaux. Une association est faite en fonction de l'exactitude de la masse théorique avec la masse expérimentale. Pour éviter une association non pertinente, une exactitude sur la masse acceptable est prédéfinie, ce qui correspond à un

taux de faut négatifs et de faux positifs minimums. En effet, plus l'exactitude sur la masse pré définie est grande, plus la chance d'avoir une fausse association augmente (faux positif). Le cas contraire est aussi possible, plus l'exactitude sur la masse pré définie est mince, plus on augmente la chance de ne pas effectuer une association pertinente (faux négatif). Lorsqu'une correspondance est effectuée entre deux spectres, un algorithme calcule un pointage pour trois paramètres, permettant de juger de la pertinence de l'association, soit le degré de correspondance et le degré de correspondance inverse.

2.3.1 Degré de correspondance

Le degré de correspondance est calculé à partir du spectre de masse expérimental et théorique et peut prendre comme valeur maximale : 1000. Si tous les signaux du spectre théorique, en respectant leur abondance relative, se retrouvent dans le spectre expérimental, le pointage donné sera le score 1000. Plus les signaux du spectre théorique diffèrent de ceux du spectre expérimental, plus le pointage obtenu sera inférieur à 1000. Par exemple, le spectre expérimental 3 aurait un degré de correspondance inférieur à 1000 et le spectre expérimental 2 aurait un degré de correspondance de 1000 (voir figure 10). Ce pointage se calcule selon l'équation 2,6.

2.3.2 Degré de correspondance inverse

Le degré de correspondance inverse est calculé à partir du spectre de masse expérimental et théorique et peut prendre comme valeur maximale: 1000. Si tous les signaux du spectre expérimental, en respectant leur abondance relative, se retrouvent dans le spectre théorique, le score donné sera le score de 1000. Plus les signaux du spectre expérimental diffèrent de ceux du spectre théorique, plus le score obtenu sera inférieur à 1000. Par exemple, le spectre expérimental 2 aurait un degré de correspondance inverse inférieur à 1000 tandis que le spectre expérimental 3 aurait un degré de correspondance inverse de 1000 (voir figure 10). Ce pointage se calcule selon l’équation 2,7:

Degré de correspondance

=

2

𝑇∗𝐿

Degré de correspondance inverse

=

2

𝑈∗𝑅

où A est la somme des produits des intensités des signaux du spectre expérimental et théorique, U est la somme des intensités au carré des signaux du spectre expérimental, L est la somme des intensités au carré des spectres de la librairie, T est la somme des intensités du spectre expérimental où l'intensité des signaux du spectre théorique est au-dessus de 0 et R est la somme des intensités du spectre théorique où l'intensité des signaux du spectre expérimental est au-dessus de 0.

Figure 10. Schéma représentant la relation entre les spectres de masse expérimentaux et

théoriques, permettant d'établir le degré de correspondance et le degré de correspondance inverse.

2.3.3 Niveau d’identification

Dans le but d’obtenir un niveau de confiance adéquat dans la détection des contaminants par analyses semi-ciblées et non ciblées, 5 niveaux d’identification ont été établis[38].

Le niveau d’identification 5 correspond à l’obtention d’une masse exacte d’intérêt par le spectromètre de masse. Pour qu’un contaminant obtienne un niveau d’identification 4, son patron isotopique expérimental doit avoir une corrélation avec le patron isotopique théorique de la librairie, ceci menant à une formule moléculaire brute. Cette corrélation est définie en assignant un pointage de corrélation minimum lors du développement de la méthode.

Pour qu’un contaminant possède un niveau d’identification 3, on doit partir de la formule brute et élucider partiellement la structure. Pour ce faire, on peut confirmer la présence des différentes fonctions chimiques composant la molécule et confirmer s’il y a possibilité d’obtenir des isomères pour la structure trouvée. On peut utiliser différentes analyses, tels l’échange hydrogène-deutérium, la RMN, la fragmentation, etc.

Pour qu’un contaminant obtienne un niveau d’identification 2, on doit obtenir une forte corrélation entre les fragments obtenus pour les spectres de fragmentation expérimentaux et les spectres de fragmentation théoriques.

Le niveau 1 est atteint lorsque l’étalon pur du contaminant est injecté dans le gradient d’analyse et que le temps de rétention obtenu pour l’étalon correspond à celui obtenu pour le contaminant dans l’échantillon.

CHAPITRE 3. MÉTHODE EXPÉRIMENTALE