Le développement de la connectivité dans les mécanismes coopératifs dépendants de l’AMPc

Le développement de la connectivité du système visuel suit un principe récurrent dans le développement du système nerveux : la compétition entre axones. Les neurones dont l’activité électrique est synchrone avec celle leur partenaire post-synaptique renforcent ce contact synaptique. En revanches, les synapses dont les activités pré- et post-synaptiques ne sont pas corrélées sont affaiblies (Hebb, 1949). De plus, lorsque des axones qui connectent le même neurone ont des activités corrélées, leurs synapses sont renforcées collectivement (Wigström and Gustafsson, 1985). Les vagues spontanées rétiniennes synchronisent la décharge de CGR adjacentes (Feller et al., 1996; Huberman et al., 2003) et pourraient donc impliquer des mécanismes coopératifs de stabilisation synaptique. Il a été montré que la co-activation d’un axone de CGR avec ses voisins stabilise ainsi les synapses rétino-tectales chez le xénope (Munz et al., 2014). Les mécanismes coopératifs entre CGR, dépendants de l’AMPc, participent au raffinement des connexions rétino-thalamiques. Ainsi, le blocage de la signalisation AMPc dans certaines CGR induit une diminution des arborisations axonales de

leurs voisines à P15. Des phénomènes de stabilisation synaptique pourraient jouer un rôle essentiel dans cette coopération entre axones.

Afin de déterminer si la connectivité des CGR est altérée lorsque la signalisation AMPc est perturbée dans certaines de leurs voisines, le développement des synapses rétino-thalamiques a été étudié, grâce à la stratégie Zaic décrite précédemment (Louail et al., en préparation). Les synapses des CGR ont été marquées grâce à une protéine fluorescente, et leur morphologie a été décrite à P15.

Résultats

Dans les plasmides ControlZaic et SpongeZaic précédemment décrits, la séquence de la synaptophysine (SYP) a été fusionnée à la protéine fluorescente tdTomato, et liée à la CFP par une séquence 2A (Figure 1 ; A). Les plasmides obtenus ont été baptisés respectivement LOKI (ControlZaic-SYP-Tomato) et THOR (SpongeZaic-SYP-Tomato). La synaptophysine est une glyco-protéine des vésicules pré-synaptiques. Elle est donc présente de façon ubiquitaire à la synapse, et peut ainsi servir de marqueur pour leur quantification (Calhoun et al., 1996). Ainsi, les cellules exprimant la CFP dans tout le cytoplasme exprimeront également tdTomato au niveau de leurs synapses. Les synapses rétino-thalamiques représentent la vaste majorité des synapses glutamatergiques dépendantes du récepteur au glutamate de type 2 (VGLUT2) observées dans le CGLd (Hammer et al., 2014; Land et al., 2004). A P15, les connexions entre CGR et cellules thalamiques sont établies (Jaubert-Miazza et al., 2005). Sur des coupes coronales de CGLd à P15, de souris électroporées in utero avec LOKI ou THOR, l’expression de SYP-tdTomato co-localise avec le marquage de VGLUT2 (Figure 1 ; B). La SYP-tdTomato est donc exprimée dans les synapses des CGR exprimant la CFP dans la stratégie Zaic. Ces outils moléculaires permettent donc l’étude des synapses des CGR voisines de celles dont la signalisation AMPc est perturbée.

Les plasmides LOKI et THOR ont été électroporés in utero, avec la Cre recombinase,

selon la methode décrite

précédemment (Louail et al., en préparation). Dans le CGLd à P15, les synapses des CGR ont donc pu être observées grâce au marquage de la SYP-tdTomato (Figure 2 ; A). La segmentation des images suivant la méthode décrite précédemment (Louail et al., en préparation) permet l’analyse des synapses de façon reproductible, rapide et indépendante de l’expérimentateur (Figure 2, B-C). La surface moyenne des synapses rétino-thalamiques à P15 est d’environ 1,20 μm2 ± 0,04 μm2 (Figure 2 ; D). La surface des synapses des CGR exprimant la CFP pourrait être réduite suite à l’expression de THOR dans les CGR (SpongeZaic-SYP-Tomato, n=1) (Figure 2 ; A-D). Le blocage de l’AMPc dans les CGR pourrait ainsi affecter le développement des synapses de leurs voisines. Lorsque les CGR sont électroporées avec THOR, et donc certaines d’entre-elles expriment cAMP-sponge, le nombre de synapses pourrait être réduit (Figure 2). Cette diminution de la quantité de synapses pourrait être corrélée à la diminution des arborisations axonales des CGR exprimant la CFP observée avec le plasmide SpongeZaic, dont THOR est un variant.

Figure 1 : Optimisation de la stratégie Zaic : expression de SYP-tdTomato au niveau synaptique (A) Les plasmides LOKI (haut) et THOR (bas) sont des adaptations de ControlZaic et de SpongeZaic, respectivement. Dans ces constructions ADN, SYP-tdTomato est fusionnée à la CFP par une séquence 2A.

(B) Coupes coronales de CGLd de souris électroporées in utero avec LOKI (haut) ou THOR (bas). La co-localisation de SYP-tdTomato (rouge) avec le marquage VGLUT2 (vert) est indiquée par les flèches. Barres d’échelle : B, 10 μm ; encadré, 20 μm.

Conclusion

Les données présentées ici décrivent deux variants des plasmides de la stratégie Zaic, décrite précédemment (Louail et al., en préparation), permettant la visualisation des synapses des CGR. Dans ces outils, la fusion de SYP à tdTomato induit le marquage des synapses en rouge, dans les cellules voisines de celles dont la signalisation AMPc est perturbée.

L’électroporation in utero de ces outils moléculaires permet d’observer la morphologie des synapses du CGLd à P15. La surface moyenne des synapses rétino-thalamiques à P15 a été évaluée à 1,20 μm2 ± 0,04 μm2 (Figure 2). Il a précédemment été démontré que la surface des synapses rétino-thalamiques chez des souris adultes est d’environ 2,43 μm2 ± 0,38 μm2

(Hammer et al., 2014). Les auteurs ont également décrit que la taille des synapses augmentait entre P5 et P14, les résultats présentés ici suggèrent que la surface de ces synapses pourrait

Figure 2 : Analyse des synapses du CGLd dans la statégie Zaic. (A)

Coupes coronales de CGLd de souris électroporées in utero avec LOKI (haut) ou THOR (bas). Les synapses sont visualisables grâce à SYP-tdTomato. Les images ont été segmentées (B) puis analysées grâce à la fonction Analyze particles

de Fiji (C). (D)

Quantification de la surface moyenne, du coefficient de circularité, et du nombre de synapses chez les souris électroporées in utero avec LOKI ou THOR. Barre d’échelle : 5 μm.

également doubler entre P15 et l’âge adulte. Les résultats préliminaires concernant l’électroporation in utero de THOR (n=1) ne permettent malheureusement pas de conclure pour le moment si le blocage de l’AMPc dans certaines CGR perturbe le développement des synapses de leurs voisines.

PARTIE 2 : Le rôle de l’activité électrique dans le développement et les