Détermination de l’effet des PVKDs sur les CSN issues de la SVZ in vitro

2.2.1 Préparation des milieux conditionnés

Les milieux conditionnés sont collectés à partir de cellules de SVZ cultivées 5 jours dans du milieu SFM complémenté ou non de vitamine K1 (10 µg/ml, Roche) ou de warfarine (1 µg.ml-1, Sigma). Après deux centrifugations de 10 minutes à 200 et 2400 g respectivement, les milieux sont concentrés environ trois fois avant leur utilisation immédiate à l’aide de microconcentrateurs pourvus d’une membrane filtrante qui permet de retenir les molécules de plus de 30 kDa (Centricon 30K, Millipore). Cette opération permet de concentrer le milieu et d’éliminer la warfarine et la vitamine K présentes dans les milieux conditionnés. L’efficacité de cette élimination sera vérifiée par HPLC en phase inverse.

2.2.2 Traitements réalisés sur les cellules issues de la SVZ in vitro

Afin d’étudier l’effet des PVKDs sur des cultures de SVZ, différents traitements sont réalisés sur des neurosphères obtenues après 5 jours de culture en présence de SFM supplémenté de 20 ng.ml−1_{d’EGF. Lors du traitement, les neurosphères sont placées dans du} SFM seul pendant 5 jours. Les sphères sont collectées, dissociées et les cellules sont

2.2 Détermination de l’effet des PVKDs sur les CSN issues de la SVZ in vitro

traitées. Chacun des traitements a été réalisé en quadruplicat et l’ensemble des expériences a été répété 3 à 5 fois.

L’étude de l’effet des PVKDs sur la croissance des cultures de SVZ a été réalisée par traitement des cellules pendant 5 jours avec :

- de la warfarine R+S (de 0 à 500 µg.ml-1, Sigma), de la S-Warfarine (0 à 10 µg.ml-1, Sigma) et /ou de la vitamine K1 (10 µg.ml-1, Roche) dans du SFM.

- des milieux conditionnés, provenant de cellules cultivées 5 jours dans du milieu SFM complémenté ou non de vitamine K1 ou de warfarine et dont la préparation est décrite ci- dessus. Le facteur de dilution de ces milieux conditionnés tient compte de son taux de concentration ainsi que du nombre de cellules ayant conditionné ce milieu de culture.

- de la protéine S humaine exogène à une concentration finale de 140 nM (Calbiochem). - de la protéine Gas6 de souris purifiée au laboratoire (se reporter à la partie 2.5.1) diluée au final au 1/200.

2.2.3 Vérification de l’élimination de la vitamine K et de la warfarine des

milieux conditionnés par HPLC

Un échantillon de chaque milieu conditionné est prélevé avant et après concentration. Pour mesurer l’éfficacité de l’élimination de la warfarine, les échantillons sont injectés directement sur une colonne analytique HPLC en phase inverse Kromasil C8 (5 μm, 100 Å, 4.6 x 250 mm, AIT). L’élution est suivie par la mesure de l’absorbance à 305 nm. La séparation est effectuée en utilisant un système de solvant eau/acétonitrile/acide trifluoroacétique 0,1% (vol/vol). Après un lavage de 5 minutes avec de l’eau, l’élution est achevée par le passage d’un gradient linéaire d’acétonitrile de 0 à 100% à une vitesse de 0,8 ml.min-1 pendant 20 minutes, suivi par un lavage d’acétonitrile 100% pendant 15 minutes.

Pour mesurer l’éfficacité de l’élimination de la vitamine K1, une extraction liquide- liquide est réalisée avant la séparation sur HPLC (Elmadfa, 1996). Pour cela, 10 ml de dichlorométhane-méthanol (2:1 v/v) sont ajoutés à 15 ml de milieu conditionné. Le tout est vortexé vigoureusement pendant 1 minute puis centrifugé 5 minutes à 4000 g. La couche de dichlorométhane inférieure est collectée. 10 ml du solvant d’extraction sont à nouveau ajoutés à la phase supérieure aqueuse, l’ensemble est à nouveau vortexé et centrifugé. La nouvelle couche de dichlorométhane est ajoutée à la première. Après évaporation de la fraction de dichlorométhane, les résidus sont dissous dans 5 ml d’hexane. Un volume équivalent de méthanol /eau (9:1 v/v) est ajouté, les échantillons sont vortexés avant centrifugation. La

2.2 Détermination de l’effet des PVKDs sur les CSN issues de la SVZ in vitro

couche supérieure d’hexane est ôtée et évaporée. Les résidus sont resuspendus dans l’éluant et injectés sur une colonne analytique HPLC en phase inverse Kromasil C8 (5 μm, 120 Å, 4,6 x 250 mm, DIONEX). Une élution isocratique est effectuée par le passage d’un mélange méthanol/ eau (99,5%/ 0,5%) à la vitesse de 1 ml.min-1. L’élution est suivie par la mesure de l’absorbance à 246 nm.

2.2.4 Mesure de l’effet des PVKDs sur la croissance et l’autorenouvellement des

cultures de SVZ

Pour analyser l’influence des PVKDs sur le nombre de neurosphères et sur la croissance des cultures de SVZ, les cellules sont maintenues en culture dans du SFM seul (contrôle) ou supplémenté en S-warfarine. A l’issue des traitements, les milieux et les neurosphères sont collectés. Les cellules sont dissociées mécaniquement et leur nombre est compté après exclusion à l’aide d’un colorant vital, le bleu Trypan.

La warfarine a également été testée pour son implication dans l’autorenouvellement des cellules souches de la SVZ. Dans les conditions de cultures réalisées, seules les cellules aux propriétés de souches sont capables de générer des neurosphères in vitro et chaque neurosphère obtenue est issue d’une cellule de type souche (Chiasson et al., 1999; Coles- Takabe et al., 2008; Morshead et al., 2003; Weiss et al., 1996). Pour réaliser ce test qui permet d’évaluer l’effet d’un traitement sur la population de cellules souches, les cellules de la SVZ sont mises en culture à raison de 5000 cellules par puits (Coles-Takabe et al., 2008) pendant 5 jours dans du SFM additionné de 20 ng.ml−1d’EGF supplémenté ou non avec 1 µg.ml-1 de S- warfarine. Après une semaine, les neurosphères primaires sont comptées. Elles contiennent des cellules souches et progénitrices. Les cellules souches contenues dans les neurosphères primaires pourront générer des neurosphères secondaires lorsqu’elles seront placées en présence d’EGF. Pour cela, les milieux sont collectés et centrifugés et les culots cellulaires sont resuspendus dans 500 μl de milieu de culture et les cellules sont dissociées mécaniquement. Les cellules sont colorées au bleu Trypan et comptées sur cellule de Malassez puis réensemencées dans du SFM supplémenté de 20 ng.ml−1d’EGF à la densité de 5000 cellules par puits. Après 5 jours, les sphères secondaires se sont développées et leur nombre est compté, ce qui permet d’évaluer le nombre de cellules de type souches qui étaient présentes dans les neurosphères primaires.

2.2 Détermination de l’effet des PVKDs sur les CSN issues de la SVZ in vitro

2.2.5 Mesure de l’effet des PVKDs sur la prolifération des cellules par

incorporation de BrdU

La prolifération des cellules de la SVZ a été évaluée par mesure de l’incorporation de BrdU, un analogue de la thymidine utilisé pour marquer les cellules en division. Lorsqu’il est ajouté dans les cultures ou administré à des animaux, le BrdU s’intègre dans l’ADN des cellules en division lors de la phase S du cycle cellulaire. Afin d’évaluer l’influence de la S- warfarine sur la prolifération des CSN, les cellules de rats nouveau-nés obtenues après 5 jours de culture dans du SFM contenant 20 ng.ml−1d’EGF sont placées en présence de S-warfarine pendant 24 heures. Le BrdU (10 μM, Sigma) est ajouté pendant les 4 dernières heures de culture. Les cultures sont fixées dans du PFA 4%, rincées avec du PBS puis perméabilisées avec une solution de triton X-100 à 0,5 % pendant 30 minutes. L’ADN est dénaturé afin de permettre le démasquage du BrdU par une incubation pendant 3 minutes en présence de 0,125 mg.ml−1de pepsine dans une solution d’HCl à 0,1N, puis par deux incubations dans du HCl 0,1N pendant 20 minutes à 4°C suivie de HCl 2N pendant 1 heure à 40°C. L’acidité est neutralisée par une incubation pendant 10 minutes à température ambiante dans du tampon borax (Na2B4O7/10H2O 0,1 M ; H3BO3 0,1 M, pH 8,4). Le BrdU est ensuite révélé par immunocytochimie. Pour cela, les cellules sont préincubées pendant une heure dans un tampon de blocage composé de 1% BSA et 0,1 % triton X-100 puis placées en présence de 5 μg.ml−1d’anticorps monoclonaux rat anti-BrdU (Harlan Sera Lab, Royaume-Uni) durant une nuit à 4°C. Après rinçage, les cellules sont incubées pendant 2 heures à température ambiante en présence de 7 μg.ml−1 d’anticorps biotinylés de lapin anti-rat (Vector). Puis, les péroxydases endogènes sont bloquées avant la révélation de l’activité peroxydase exogène et le montage des lamelles sont montées comme précédemment décrit. Le comptage des cellules est réalisé sous microscope en utilisant le logiciel Neurolucida. La prolifération est exprimée en pourcentage de cellules immunomarquées au BrdU par rapport au nombre total de cellules.

2.2.6 Mesure de l’effet des PVKDs sur l’apoptose par marquage TUNEL

Afin d’évaluer l’effet des PVKDs sur la mort cellulaire, nous avons procédé à une détection des cellules en apoptose. Lors de l’apoptose, l’ADN est dégradé en fragments qu’il est possible de détecter à l’aide de la technique TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labelling). Pour cela, les cellules sont traitées avec 1 µg.ml-1 de S-warfarine pendant 24 heures. A l’issue du traitement, les cellules sont fixées pendant 1 heure dans du PFA 4% puis

2.2 Détermination de l’effet des PVKDs sur les CSN issues de la SVZ in vitro

perméabilisées avec une solution de PBS contenant 0,5% de triton X-100 pendant 30 minutes. L’activité des peroxydases endogènes est bloquée avec une solution d’H2O2 à 3% dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Après rinçages, les cellules sont incubées pendant 1 heure à 37°C en présence de 0,25 U.µl−1 d’enzyme Terminal Transferase (Boerhinger, Allemagne) et de 6 μM de dUTP biotinylé (Boehringer) dans un tampon contenant 30 mM de Tris HCl, 140 mM de Cacodylate de sodium et 1 mM de CoCl2. La réaction enzymatique est arrêtée par l’incubation des cellules dans du tampon contenant 300 mM de NaCl et 30 mM de Citrate de sodium pendant 15 minutes à température ambiante. Après plusieurs rinçages dans du PBS, les dUTPs biotinylés sont détectés par le complexe Avidine-Biotine, l’activité peroxydase est révélée et les lamelles montées comme précédemment décrit.

2.2.7 Mesure de l’effet des PVKDs sur la différenciation cellulaire

L’étude de l’effet des PVKDs sur la différenciation des CSN s’est faite par traitement des cellules pendant 5 jours dans du SFM supplémenté ou non de 1 µg.ml-1 de S-warfarine. Cet effet a été évalué par l’immunomarquage d’antigènes spécifiques de neurones, de cellules gliales et d’oligodendrocytes comme décrit dans la partie 2.1.2 de cette partie expérimentale.