L’expérimentation décrite ci-dessous vise à évaluer deux paramètres. Il s’agit d’une part d’évaluer la pertinence d’un sac d’homogénéisation (Stomacher VWR) instrumenté, mais aussi de mettre en œuvre la détection multi-capteurs.
Afin d’accueilir les xérogels, le sac d’homogénéisation est muni de logements (Figure IV.29). Ceux-ci sont composés d’un scotch Gene Frame stérile qui permet de fixer une poche filtrante également sétrile.
L’instrumentation directe d’un sac d’homogénéisation permettrait de coupler crois- sance bactérienne et détection. Cependant la géométrie d’un tel sac est très différente des montages précédents, de faite la migration et le comportement de COV peut être forte- ment impacté. De plus les volumes analysés sont nettement plus conséquents (centaines de millilitres), entrainant une dilution des COV, ce qui peut être un frein à la détection. La détection multi-capteurs implique l’utilisation de plusieurs capteurs différents en parallèle. Chaque capteur cible et révèle un COV particulier. Cependant l’ensemble des COV vont être captés par les différents capteurs. Il y aura donc un effet de dilution des COV au sein des trois capteurs. La fraction de COV captée par son capteur révélateur sera-t-elle suffisante pour le détecter ? Cette question de sensibilité est primordiale en effet
Fig. IV.29 – Sac d’homogénéisation Stomacher instrumenté : Schéma(a) et photogra- phie(b)
La matrice alimentaire testée se compose d’aiguillettes de poulet achetées sous vide en grande surface. Trois COV dont la détection est assurée par trois capteurs ont été ciblés. L’activité β − glucuronidase a été recherchée via la dégradation du substrat β- GUR-2NP. La détection de l’H2S a été ciblée par un capteur DTNB. La mise en évidence
de l’indole a été recherchée en continu à l’aide d’un capteur DMACA-PSS-TFA puis en point final par un capteur DMACA catalysé HCl.
La charge bactérienne introduite est très nettement supérieure aux normes en vigueur. Il s’agit en effet d’observer si la détection est réalisable. L’ensemble du protocole expéri- mental est détaillé en annexe (p. 192).
Des spectres d’absorbance de chacun des xérogels sont réalisés à t0, 8 h, 24 h, 32 h
et 48 h.
Les spectres de xérogels DMACA catalysés HCl sont mesurés à t1=t0 +48 h, t1 +2 h,
t1 + 4 h, t1 + 8 h.
Résultats expérimentaux
Le tableau IV.16 présente les résultats de l’exposition des xérogels à deux bactéries et un milieu témoin au sein d’un sac stomacher instrumenté ainsi que dans les tubes. L’ensemble des milieux a émis de l’H2S et de l’oNP tandis que, dans aucun cas le capteur
DMACA-PSS-TFA ne révèle la présence d’indole. Alors que les capteurs DMACA-HCl révèlent rapidement la présence d’indole.
Le format d’analyse en tubes conduit à une détection plus précoce que le format sac stomacher instrumenté. Il est également important de remarquer que la cinétique de
détection est plus rapide pour les échantillons artificiellement inoculés E.coli que pour les échantillons contenant uniquement la flore locale.
t0 t1=t0+48h COV ciblé Indole H2S 2-NP Indole Formulation Xérogel DMACA-PSS-TFA DTNB ABTES15% DMACA-HCl
Sac
EC28 - + 32 h + 32 h + 8 h
HA54 - + 48 h + 48 h + 8 h
Témoin / flore locale - + 48 h + 48 h + 8 h
T
ub
es
EC28 - + 8 h + 8 h + 2 h
HA54 - + 24 h + 24 h + 2 h
Témoin/ flore locale - + 24 h + 24 h + 2 h
Tab. IV.16 – Résultats de l’exposition des capteurs au sein d’un sac instrumenté et de tubes individuels. Les - figurent l’absence de détection, les + les échantillons positifs. Les temps précisés à coté correspondent aux temps de détection. Le cas du xérogel DMACA-PSS-TFA, exposé à EC28 en tube individuel, est intéressant. En effet, après 48 h une bande d’absorbance à 360 nm est visible. Il ne s’agit pas de l’indole mais, probablement, de la forme protonée du 2-NP. La capture des COV par les xérogels n’est pas spécifique.
Flore locale
Les comptages effectués sur l’échantillon témoin ont révélé la présence d’une flore locale présente initialement dans la matrice alimentaire. Cette flore locale a conduit à une détection positive des capteurs H2S, 2-NP et DMACA-HCl. La dégradation du substrat
par la flore locale est cohérente avec des coliformes. L’émission de l’indole et d’H2S oriente
vers E.coli. Une culture sur milieu chromogénique ChromID coli indique la présence de coliformes et de E.coli.
La présence de cette culture pose la question des témoins. Ici en effet, la non stérilité de la matrice perturbe l’expérimentation. Les trois conditions de culture (EC28, HA54 et Témoin) conduisent de par la présence de la flore locale à la même réponse : seul le sac instrumenté et le tube, où EC28 a été inoculée, se distinguent par une cinétique de détection plus rapide.
Effet de confinement
La comparaison des essais en sac d’homogénéisation instrumenté et en tubes montre que les tubes conduisent à une détection en moyenne 24 h avant les sacs instrumentés. Ces résultats mettent en évidence que l’effet de confinement est favorable à la détection. L’utilisation de sacs instrumentés était motivée par la volonté d’analyser une masse de 25 g de viande afin de se rapprocher des normes en vigueur. Cette démarche conduit à
Par ailleurs, le xérogel DMACA-PSS-TFA exposé à EC28 en tube individuel pré- sente après 48 h une bande d’absorbance à 360 nm. Il ne s’agit pas de l’indole mais pro- bablement de la forme protonée du 2-NP. Ce phénomène met en évidence que la capture des COV par les xérogels n’est pas spécifique contrairement à la transduction.
IV.5.1
Conclusion et perspectives
La présence d’une flore locale, au sein d’échantillons achetés dans le commerce, pose la question des témoins. En effet, pour avoir de vrais témoins, il est nécessaire d’avoir des matrices alimentaires stériles ; l’une des méthodes testées pour stériliser les viandes commerciales est l’irradiation aux rayons gamma.
Cependant cette flore locale a pu être détectée et identifiée via le système multi- capteur. Le résultat est donc mitigé. Certes, la détection et l’identification de E.coli en flore locale a été possible mais, d’une part, les temps de détection sont trop longs pour une application industrielle et, d’autre part, elle a nécessité le recours à la formulation DMACA-HCl qui est incompatible avec la présence d’autres capteurs. Enfin, le prototype instrumenté visait à répondre aux critères de sécurité des denrées alimentaires du jour- nal officiel de l’Union Européenne qui impose d’analyser une masse donnée9 de matrice
alimentaire. Cependant, ce premier prototype montre des limites dans la diffusion des COV au sein du sac. D’une part, les xérogels sont trop éloignés de la matrice alimentaire pour être efficacement en contact avec les COV. D’autre part, le volume d’air au-dessus de la matrice dilue la concentration de COV en phase gazeuse. Cependant, pour que la croissance bactérienne ciblée(en aérobie) puisse avoir lieu la quantité d’oxygène disponible doit restée suffisante. Aussi, un optimum entre ces deux paramètres doit être déterminé. Le couplage avec un système micro fluidique permettrait d’orienter le flux, favorisant son passage au sein des xérogels et une concentration du COV au sein du matériau. Une meilleure sensibilité serait de fait attendue.
9. Dans le cas de Salmonella, par exemple, une absence de la bactérie doit être constatée dans 25 g pour les viandes hachées et préparations de viande destinées à être consommées crues ainsi que les viandes hachées et préparations de viande de volailles destinées à être consommées cuites
Effet de confinement
La comparaison des essais en sac d’homogénéisation instrumenté et en tubes montre que les tubes conduisent à une détection en moyenne 24 h avant les sacs instrumentés. Ces résultats mettent en évidence que l’effet de confinement est favorable à la détection. L’utilisation de sacs instrumentés était motivée par la volonté d’analyser une masse de 25 g de viande afin de se rapprocher des normes en vigueur. Cette démarche conduit à un volume d’environ deux tiers du volume du sac. Par ailleurs, il est difficile de placer les xérogels plus bas dans le sac ; d’une part, cela augmenterait le risque d’introduire des contaminations apportées par l’expérimentateur lors de l’introduction des xérogels, et d’autre part les xérogels pourraient recevoir de projections des milieux lors de l’agitation. La géométrie du tube est plus favorable. En effet, le volume mort ne représente que la moitié du tube, il est donc proportionnellement au volume total beaucoup plus faible dans le cas du montage en tube que dans celui du sac d’homogénéisation. De plus les xérogels sont spatialement plus proches du milieu.