l’identification de pathogènes
La détection des COV ciblés s’est fait en couplant plusieurs modes de transduction et voies enzymatiques. Cette combinaison avait pour but de distinguer des pathogènes courant cause d’infections majeures. Ainsi E.coli a été ciblée via son COV caractéristique l’indole. La quantité de pont disulfure, présente naturellement dans le milieu nutritif, s’est révélée trop faible pour être détecté : du Na2S3O2 a dû être rajouté pour mettre en
évidence l’activité chez Salmonella et E.coli. Les activités α-glucosidase et C8-estérase ont été révélées chez la plupart des bactéries de notre panel de façon plus ou moins significative. Cela empêche une identification directe via la spécificité enzymatique.
E.coli s’est avérée être capable de dégrader l’ensemble des substrats enzymatiques que nous avons testés. De plus, les cinétiques de dégradation des substrats par E.colis ne sont pas très éloignées de celles des pathogènes comme S.aureus et Salmonella. Ce constat montre les limites de la détection par voies enzymatiques. En effet, E.coli est une bactérie extrêmement commune ; sa croissance, au sein de matrices alimentaires risque d’induire un nombre considérable de faux-positifs.
E.coli est Gram négative (Gram−), contrairement à S.aureus. L’ajout d’un anti- Gramˆ- au milieu permettrait d’inhiber la croissance E.coli tout en préservant celle des staphylocoques. Cependant, Salmonella étant elle aussi Gram−, cette méthode ne peut
donc être appliquée pour spécifier sa détection. En revanche, la présence de E.coli in- duit la production d’indole. La distinction entre E.coli et les autres bactéries peut donc
tinente du fait de la forte réactivité du DMACA et de l’indole en présence de HCl. Un système de bulle plastique perçable a ainsi été envisagé. Cependant, ce montage ne permet pas une détection précoce.
En définitive, la spécificité enzymatique apparait être liée à la cinétique de détection. Certaines souches de bactéries clivent le substrat quasi spontanément, tandis que d’autres ont besoin d’un temps de latence avant de le dégrader. Il apparait intéressant, de prime abord, de mettre en place un protocole de spécificité enzymatique basé sur la cinétique du capteur de COV. Cependant, cette démarche est complexe. En effet, la cinétique de capture du COV dépend de la quantité de COV libérée donc de la charge bactérienne à t0,
qui n’est, par définition, pas connue, lors d’un contrôle sanitaire. Pour s’affranchir de son effet, il faudrait normaliser l’absorbance du xérogel par la charge bactérienne. Cependant, cette méthode impose une étape de numération en parallèle. Or, cela s’avère limitant car, la numération sur boîte peut s’avérer très complexe si l’échantillon est poly-microbiens. Au vu de ces contraintes, la technologie perd de son intérêt au profit des milieux spécifiques chromogéniques sur boites de Pétri.
méthodes de détection et d’identification des pathogènes tels que E.coli, S.aureus, Salmo- nella sont donc d’une importance primordiale. Ces techniques doivent allier sensibilité et spécificité sur le plan microbiologique tout en étant facile d’usage, avec un faible coût de revient.
L’analyse des métabolites microbiens en phase gazeuse est la voie que nous avons explorée pour répondre à ce besoin. En effet, l’analyse des COV permet, d’une part, de s’affranchir de la complexité du milieu de culture et de prolifération et, d’autre part, d’apporter un caractère non invasif au contrôle.
Ces travaux de thèse se sont donc inscrits dans un contexte de capteurs en phase gazeuse, sélectifs, rapides, faciles à utiliser, ayant un faible coût de revient. La mise en place de capteurs chimiques permet d’obtenir des sélectivités particulières et complémentaires. L’emploi de matériaux sol-gel vise, quant à lui, à accroitre la sensibilité par accumulation et permettre une transduction optique tout en obtenant un capteur préhensible.
Deux axes ont donc été étudiés. Le premier traite de l’analyse globale du profil ol- factif, c’est-à-dire d’une fraction du métabolome volatil d’un pathogène. Deux modes de transduction (spectrométrie d’absorbance et de fluorescence) ont été considérés. Le se- cond axe est une analyse partielle, ciblée sur les COV les plus significatifs par les biais de réactions sonde-cible pour les COV endogènes et d’activité enzymatiques dans le cas de COV exogènes.
Pour répondre à la problématique que pose une analyse globale du profil olfactif deux démarches ont été menées. La mise en place d’un nez colorimétrique étudie les différentes interactions chimiques qu’il est possible de mettre en évidence entre les COV microbiens et des molécules chimiosensibles choisies en fonction de leurs propriétés et réactivités. L’analyse de matrices d’excitation-émission (EEM) de fluorescence vise à cibler et identifier les COV à l’aide d’un unique capteur sol-gel grâce à un double balayage en longueurs d’onde. L’analyse des EEM a tout d’abord été effectuée en solution aqueuse puis confrontée à la transposition en matrice nanoporeuse.
sibles. Ces molécules sondes ont été sélectionnées en fonction de leur réactivité (acide-base de Lewis et de Brønsted, solvatochromisme ou encore réaction covalente). Leur état ini- tial au sein des monolithes de xérogels est contrôlé par le groupement fonctionnel (chaine alkyle ou groupement NH2) porté par les précurseurs fonctionnalisés. L’évaluation des
spectres d’absorbance a été étudiée par analyse en composantes principales. La confron- tation du nez colorimétrique à des COV modèles n’a pas conduit à des résultats pertinents. Il a, par contre, été possible de détecter la présence de bactéries sur géloses, sans toutefois parvenir à distinguer les espèces. Dans un milieu d’hémoculture, il n’a pas été possible de s’affranchir des composés relargués provenant de l’échantillon. L’étude des valeurs propres issues de la PCA montre que l’information utile est obtenue grâce aux capteurs acido- basiques. Dans ce cas, ce mode de traitement de données n’apporte pas plus d’information qu’une simple lecture colorimétrique.
L’exploitation des matrices d’excitation-émission de fluorescence issues d’un double balayage en longueur d’onde a été mis en œuvre sur deux COV modèles l’indole et le β- naphtol en solution aqueuse. La détection est réalisée mais la distinction entre composés s’avère délicate. La transposition de la méthode au sein d’un matériau xérogel s’est avérée conditionnée par la production de xérogels non fluorescents. L’élaboration d’un protocole de synthèse dédié a permis d’obtenir un nombre de monolithes permettant de réaliser la détection de COV via les xérogels. Les COV sont alors issus de solutions aqueuses. Comme lors de la caractérisation directe des liquides, la détection est permise mais les motifs formés par les deux COV ne sont pas assez distincts pour permettre une identification. Cette approche a montré la grande sensibilité des sol-gels aux polluants extérieurs. Ces interférents, certes néfastes à la détection des pathogènes, montrent néanmoins le potentiel de la détection par fluorescence en terme de sensibilité. Ainsi, la détection par fluorescence demeure une voie très intéressante et prometteuse mais nécessite un contrôle parfait de la production et du stockage avant usage.
L’analyse globale du profil olfactif s’étant révélée difficile à mettre en œuvre, que ce soit par la mise en place d’un nez colorimétrique ou l’analyse d’une matrice d’excitation- émission, il a par la suite été préféré de ne cibler que certains COV d’intérêt majeur. Il s’agit soit de COV endogènes caractéristiques d’une bactérie d’intérêt en agroalimentaire soit de COV exogènes révélant une activité enzymatique spécifique.
Le mode de détection le plus courant pour la détection de COV endogènes est lié à des réactions sondes-cibles spécifiques. L’adsorption des COV dans la matrice est non spécifique, alors que la transduction mise en place doit l’être le plus possible. La détection de H2S et des mercaptans par rupture du pont disulfure de la molécule DTNB
est une méthode répandue. Des travaux antérieurs ont mis au point un capteur TMOS basé sur cette réaction. Il a donc été proposé ici de transposer cette réaction au sein d’une
catalysés HCl.
La problématique de la substitution de l’HCl peut être poursuivie en incorporant de l’acide paratoluènesulfonique. Cet acide présente un pKa très acide, -1.34, ainsi qu’une constante de Henry faible, 1,11.10−7 : il est donc peu volatil.
La mise en place de réactions sonde-cible au sein de xérogel étant complexe et pas toujours adaptable aux détections multi-capteurs, une autre voie explorée a été la détec- tion intrinsèque des COV. L’indole a ainsi pu être détecté par absorbance et fluorescence sans sonde. Outre les COV endogènes, deux COV exogènes ont été détectés sans molécule sonde. Lors de ce type de détection, la spécificité provient de l’activité enzymatique mise en œuvre lors de la dégradation du substrat et la libération du COV. Trois bactéries, E.coli, S.aureus et Salmonella, ont ainsi été ciblées à partir de leur activité enzymatique respective. La transposition de ce type de détection à une transduction sol-gel a soulevé plusieurs points.
La spécificité enzymatique s’avère une question de cinétique de clivage du substrat et de détection du COV : la vitesse de libération du COV est directement liée à la préfé- rence ou non des bactéries pour dégrader le substrat plutôt que les sources de carbone disponibles dans le milieu ; l’accumulation du COV dans le sol-gel dépend de la solubilité des métabolites dans le milieu et de leur capacité à passer en phase gazeuse. Plusieurs bactéries peuvent ainsi être capables de dégrader un même substrat, l’activation de la voie enzymatique, dépendante de leur métabolisme et de l’environnement dans lequel elles se trouvent, peut-être plus ou moins retardée. Pour ne cibler qu’une seule espèce, et s’assurer qu’il y ait corrélation entre détection du COV et présence de l’espèce recher- chée, il est donc nécessaire de coupler cette recherche d’activité enzymatique avec l’usage d’inhibiteurs de croissance spécifique pour cibler une bactérie. Ce travail sur les voies en- zymatiques spécifiques a été l’occasion de mettre en place une méthode de numération de E.coli via la voie enzymatique β-GAL selon la méthode du nombre le plus probable et les tables de McGraddy. Les numérations ont pu être effectuées selon des tests à cinq, huit et dix essais par décade de dilution. Cette méthode permet de répondre à la problématique
des seuils de bactéries tolérées dans les matrices alimentaires, comme c’est souvent le cas pour E.coli, plus rapidement que par la méthode standard, qui est le comptage sur boites. Enfin un test multicapteurs a été mené sur un échantillon commercial de viande de poulet. Les normes sanitaires imposent le contrôle d’un volume donné de matrice alimen- taire. Aussi le format de l’expérimentation choisi a été celui de sacs d’homogénéisation instrumentés. Il s’agissait de détecter et de distinguer Escherichia coli et Hafnia alvei. Ce test a mis en évidence la non spécificité des capteurs des COV par les différents mono- lithes. Un compromis est donc nécessaire entre la multiplication du nombre de capteurs différents afin d’avoir l’identification la plus précise possible et l’accumulation non sé- lective du COV au sein des capteurs tend à retarder la transduction donc la détection. La flore locale nous a privé de témoins sans bactérie mais a montré la capacité de nos capteurs à détecter la présence de bactéries à des concentrations admises dans les circuits agroalimentaires.
Ces travaux ont donc mis en évidence les limites et les contraintes que présentent chacune des voies étudiées. Elles sont globalement liées au manque de spécificité de la réponse : la détection de pathogène est aisée, leur identification est, elle, plus complexe.
La caractérisation approfondie et systématique des matériaux, notamment par analyse BET et SAXS permettra d’aboutir à une connaissance fine et précise de la structure et de la porosité des xérogels. Contrôler la chimie de surface permettra d’élaborer une gamme complète de matériaux répondant à des cahiers de charges distincts. Par ailleurs, le format monolithique des xérogels, qui était a priori facile de mise en forme et d’utilisation, se révèle ne pas être adapté pour gagner en sensibilité. En effet, l’épaisseur du matériau est un frein, dû au temps nécessaire à la diffusion du gaz à l’intérieur. Augmenter le rapport surface sur volume du xérogel permettrait d’atteindre plus rapidement l’équilibre d’accumulation et de gagner en cinétique de détection via l’utilisation de couches-minces. Les couches-minces offrent de plus la possibilité d’être couplées avec d’autre mode de transduction très sensibles comme de la résonance des plasmons de surface (SPR) avec le dépôt d’une couche sol-gel fonctionnalisée à la surface du prisme. Les couches minces sol-gel devront être plus fines que l’onde évanescente. L’épaisseur du sol-gel permettra d’utiliser l’onde évanescente non plus uniquement sur une surface mais dans un volume. L’un des défis de cette technologie sera d’inclure des ligands dans le sol-gel, tout en conservant leur accessibilité.