C. Miniaturisation
1) Détection colorimétrique dans un dispositif microfluidique d’analyse à base de
L’idée d’utiliser l’approche d’un dispositif microfluidique d’analyse à base de papier, l’optimisation du protocole de fabrication et la preuve de concept de la décomposition ont été réalisées lors de mon séjour à l’Université de Goiânia (Brésil ; Pr W Coltro) dans le cadre du projet CAPES-COFECUB coordonné par le laboratoire et avec Maryllia (Brésil, étudiante de pharmacie) qui a travaillé sur le même sujet dans le cadre de son Master. Dans le cadre de mes propres travaux de thèse, j’ai évalué la miniaturisation de détection des RSNOs par la méthode de Saville et par la lumière, normalement effectué par spectrophotométrie.
Les dispositifs microfluidiques d’analyse à base de papier ont été réalisés en forme d’étoile en utilisant l’impression de cire sur papier. Ce dispositif a été choisi pour réaliser la décomposition simultanée des RSNOs dans différentes zones en utilisant dans chacune d’entre elles un protocole de décomposition different : Hg2+, lumière visible, UV ou infrarouge. Ainsi, des
solutions étalons de GSNO, CySNO, et AlbSNO ont été utilisées. Le réactif de Griess a été utilisé dans chacune de ces zones afin de révéler la couleur indicatrice du composé diazoté, lui- même indicateur du nitrite issu de la décomposition. Un scanner a été utilisé pour capturer la photo couleur du dispositif, par la suite analysée à l’aide du logiciel Corel photo-paint qui permet d’avoir les intensités d’une couleur spécifique (rose par exemple) (Figure 16). L’intensité de la couleur est proportionnelle à la quantité de nitrite formé et par conséquent des RSNOs initial.
26 Figure 16 : Illustration des différentes étapes de détection des RSNOs sur dispositifs microfluidiques d’analyse à base de papier : injection des RSNOs au milieu, décomposition (lumière et sel de mercure), addition du réactif de Griess, scan et analyse par le logiciel Corel photo-paint. Des courbes de calibrage
peuvent alors être établies pour déterminer les concentrations dans des échantillons inconnus. Dans un premier temps, l’anion nitrite a été utilisé comme référence, afin de vérifier la linéarité des courbes d’étalonnage en utilisant les microsystèmes. Elle a donné une courbe linéaire de pente 0,36 A.U / µM avec un R2 supérieur à 0,99. Dans le cas de GSNO, des courbes
d’étalonnage linéaires ont été obtenues pour sa décomposition par Hg2+, lumière UV, Visible,
et infra-rouge. La méthode la plus sensible est celle qui consistait à décomposer GSNO par le Hg2+ (pente la plus élevée). La décomposition par Hg2+ a été démontrée comme quasi-totale,
elle est quantitative car la valeur de la pente est très proche de celle obtenue dans les mêmes conditions pour l’anion nitrite. La décomposition par UV après 20 min d’illumination conduit à une décomposition partielle, celle induite par irradiation dans le domaine du visible est encore moins efficace que par UV et finalement l’illumination infra-rouge ne conduit à aucune décomposition (Figure 17a).
Concernant le CySNO, la décomposition par illumination par lampe UV pendant 5 minutes est totale et identique à celle induite par Hg2+. La décomposition par illumination dans le domaine
du visible est moins importante que les deux procédures précédentes, mais elle reste meilleure
Décomposition Appareille fabriquée en utilisant imprimante 3-D
développement de la
couleur Détection Analyse
Appareil fabriqué en utilisant une imprimante
3-D
Développement de la couleur
Resumé des travaux de thèse
27 que la décomposition de GSNO par la lumière IR. L’infra-rouge ne conduit à aucune décomposition (Figure 17b). Concernant l’AlbSNO, la décomposition est totale uniquement avec Hg2+ (Figure 17c).
En conclusion, un microsystème a été mis au point et a permis d’étudier de façon simple la décomposition de plusieurs RSNOs sous l’effet de différents paramètres. La décomposition par Hg2+ est quantitative et la plus rapide pour tous les RSNOs. Les RSNOs BPM, GSNO et
CysNO, sont plus sensibles vis à vis de la décomposition par lumière que les RSNOs HPM tels que AlbSNO.
Figure 17 : Courbes dose-réponse caractéristiques de la décomposition de a) GSNO, b) CysNO et c) AlbSNO mesurée en dispositifs microfluidiques d’analyse à base de papier après décomposition par Hg2+,
lumière UV et visible.
La possibilité de détection des RSNOs dans des échantillons de plasma a aussi été évaluée. Le plasma a une couleur légèrement jaune à cause des protéines et spécialement de l’albumine ce qui engendre une difficulté de mesure basée sur l’approche colorimétrique développée ici. De ce fait, il est nécessaire de procéder soit à une ultrafiltration, soit à une étape permettant d’éliminer les protéines de HPM. Cette procédure conduit aussi à l’élimination des HPM- RSNOs. Ceci nous a conduits à développer une méthodologie qui permette de quantifier les
0 20 40 60 80 0 10 20 Hg2+ UV Vis C ol or inte ns ity (A .U ) AlbSNO (µmol/L)
c
28 différents composants du plasma (Figure 18). Cette méthodologie peut être résumée comme suit :
- Décomposition des RSNOs avant filtration du plasma : dans ce cas l’ensemble des RSNOs HPM et BPM seront quantifiés, en plus du nitrite déjà présent ;
- Décomposition des RSNOs après filtration (ou déprotéinisation) du plasma : dans ce cas seuls les RSNOs BPM seront quantifiés, en plus du nitrite déjà présent ;
- Absence de décomposition : dans ce cas seul le nitrite initialement présent dans le plasma est quantifié.
Les concentrations de chaque composant (nitrite, RSNOs HPM et BPM) peuvent ainsi être obtenues par simple soustraction des données obtenues suivant ces trois protocoles (
Tableau 4). Les résultats montrent que seul les nitrites et RSNOs peuvent être détectés à
cause de leur concentration plus élevée que la limite de détection. La concentration en nitrite se situe entre 37 et 58 µM et en AlbSNO entre 5 et 16 µM. Cela est en accordance avec des rapports précédents par Stamler et al. [53] et autres ([2] et références incluses). Dans certaines maladies, la concentraiton en RSNOs BPM augmente au délà de 3 µM, alors ils pourront être détectés.
Figure 18 : Schéma de la méthode mise en oeuvre pour détecter les RSNOs dans le plasma. Plasma Decomposition Hg2+ Griess Reagent Filte rH MW -RSNO Filte rH MW -prot eins Inject filtrate Griess Reagent Nitrite+ HMW-RSNO+ LMW-RSNO NO2- LMW HMW NO2- NO2- LMW HMW NO2- LMW Blanc: Nitrite Hg2+: Nitrite+LMW- RSNO
Resumé des travaux de thèse
29 Tableau 4 : Concentrations en nitrite et RSNOs HPM et BPM dans les échantillons de plasma mesurées en dispositif microfluidique d’analyse à base de papier
Sample Nitrite (µM) RSNOs HPM (µM) RSNOs BPM (µM)
1 49,9±2,3 14,0±2,9 < LOD
2 49,5±3,8 4,5±2,4 < LOD
3 37,5±3,3 5,7±2,7 < LOD
4 58,5±3,4 16,2±3,6 < LOD