Les détails moléculaires de la synthèse des télomères dans les cellules ALT

Les détails moléculaires de l'extension des télomères dans les cellules ALT ont longtemps été considérés comme une énigme. La réplication génomique induite par la voie de BIR dans les cellules humaines dépend de la sous-unité POLD3 de la polymerase Polδ (Costantino et al., 2014). POLD3 est nécessaire pour stabiliser le complexe Polδ et interagit directement avec PCNA, appelée protéine à pince coulissante qui se lie aux ADN polymérases afin d'augmenter leur processivité pour l'ADN (Ducoux et al., 2001). PCNA est aussi impliquée dans le déplacement des brins lors de la recombinaison, elle participe à la réplication en se fixant sur l‟ADN par le facteur RFC (Replication factor C). Deux articles récents ont identifié POLD3 comme étant le principal constituant d'un replisome requis pour la synthèse conservatrice des télomères endommagés par la voie de BIR dans les cellules ALT. La première étude a utilisé un protocole de triple FISH pour distinguer les deux types de réplication de l'ADN télomérique : semi-conservatrice et conservatrice (Roumelioti et al., 2016) (Figure 19). En effet, la délétion de POLD3 a diminué la fréquence des télomères ALT répliqués de façon

76 conservatrice, marqueurs de la voie de BIR, ainsi que le signal télomérique dans les cellules métaphasiques, suggérant une baisse de la longueur des télomères induite par la voie de BIR.

La deuxième étude a montré un recrutement intense de POLD3 au niveau des CDB télomériques générées par le système TRF1-FokI, et l‟absence de POLD3 entraînait une diminution de la synthèse des télomères induite par la voie de BIR (Dilley et al., 2016). Cette dernière étude a révélé aussi que le chargement rapide de PCNA médié par le facteur RFC au niveau des télomères endommagés semblerait le premier senseur du dommage à l‟ADN sur lequel le replisome non canonique comprenant Polδ-PCNA-RFC1 s‟assemblerait afin d‟initier la synthèse des télomères par la voie de BIR indépendante de rad51. D‟autre part, le chargement de Rad51 et de Hop2 au niveau des télomères endommagés ainsi que les recherches

Figure 19 : Réplication conservative de l'ADN au niveau des télomères des cellules humaines ALT

La technique de triple FISH est utilisée pour distinguer entre la réplication semi conservative et conservative de l'ADN télomérique. Les exemples de chromosomes illustrés en représentation schématique (à gauche) ainsi qu‟en image réelle (à droite) montrent la réplication télomérique semi- conservatrice (Semi) et conservatrice (Consrv) sur la totalité du télomère (E) ou bien sur une partie du télomère (P). D‐FISH, denaturing FISH; ND‐CO‐FISH, non‐denaturing CO‐FISH (Roumelioti et al., 2016).

77 d'homologie à distance qui en résultent se produisent plus lentement et ne sont pas essentiels pour la majeure partie de la synthèse de l‟ADN télomérique mediée par la voie de BIR.

D‟une manière intéressante, une étude a montré que les télomères des cellules ALT étaient enrichis par plusieurs facteurs impliqués dans la synthèse de l'ADN translésionnelle (TLS), tel que l‟ADN polymérase Polη (Garcia-Exposito et al., 2016). TLS constitue un processus par lequel les ADN polymérases de basse-fidélité sont capables de contourner les lésions de l'ADN lors de la réplication (Sale, 2013). L‟absence de Polη conduisait à une synthèse tardive de l'ADN télomérique par POLD3 dans les cellules ALT. Les auteurs ont proposé un rôle important de Polη dans le control du stress réplicatif au niveau des télomères ALT stimulant par la suite la synthèse de l'ADN télomérique par la polymérase Polδ (Garcia- Exposito et al., 2016).

Une fois l'étape de synthèse télomérique accomplie, la structure intermédiaire ou D-loop subit soit une résolution soit une dissolution générant des produits croisés et/ou non croisés, comme déjà mentionné. Dans les cellules humaines, la résolution est catalysée par la nucléase SLX4, qui recrute les endonucléases spécifiques tel que SLX1, MUS81-EME1 et ERCC1 / ERCC4 (Svendsen et al., 2009, Sarbajna et al., 2014). En revanche, la dissolution est catalysée par l'hélicase BLM de type RecQ ainsi que d‟autres protéines associées tel que TOP3A et RMI1/2 formant un complexe appelé BTR (Wu and Hickson, 2003, Wu et al., 2006). Sobinoff et ses collaborateurs ont révélé que BLM et SLX4 sont activement engagées pour traiter les structures intermédiaires de la recombinaison au niveau des télomères ALT (Sobinoff et al., 2017). En effet, SLX4 augmentait la fréquence des T-SCE détectées par CO-FISH au niveau des télomères ALT, cela a été considéré comme un marqueur positif de l'activité ALT. Toutefois, cette augmentation de l'échange télomérique est contrecarrée par BLM, qui, en plus de son activité hélicases, catalysait la dissolution grâce au complexe BTR (Figure 17).

D‟autre part, SLX4 empêchait le recrutement de POLD3 au niveau des télomères inhibant ainsi l‟allongement télomérique dans les cellules ALT, alors que BLM favorisait ce recrutement conduisant à une synthèse de longues séquences télomérique mediée par la voie de BIR. Cette synthèse induite par BLM est partiellement dépendante de Rad51 prouvant l‟implication d‟une recombinaison inter-télomérique. Par conséquent, les auteurs ont apporté

78 une preuve supplémentaire sur le rôle de BLM et SLX4 dans la recombinaison inter- télomérique (Figure 17). En effet, en marquant les télomères par une étiquette, la surexpression de BLM a provoqué une augmentation des étiquettes inter-télomériques, alors que la surexpression de SLX4 a conféré l‟effet opposé. Bien que Rad51 déclenche les événements de synthèse des télomères, BLM était toujours capable de promouvoir l'extension télomérique en absence de Rad51. Ils ont proposé que les événements de synthèse indépendants de Rad51 peuvent être le résultat d'une recombinaison intra-télomérique où le chargement de POLD3- PCNA-RFC1 au niveau des télomères endommagés est plus rapide que celui de Rad51 et de Hop2 (Dilley et al, 2016), et que BLM facilite ces événements intra-télomérique en éliminant les structures télomériques qui gênent la synthèse des télomères (Biffi et al, 2013) (Figure 18).

Ces données évoquent ensemble que le complexe BTR favorise la synthèse des télomères par la voie de BIR suivie par la dissolution télomérique et que BLM nécessite à la fois POLD3 et Rad51 pour initier ces événements. Toutefois, la synthèse des télomères est contrecarrée par le complexe SLX4-SLX1-ERCC4, qui inhibe l'association de POLD3 au niveau des télomères favorisant ainsi la résolution télomérique. Par conséquent, la résolution ou la dissolution des intermédiaires de recombinaison formés suite à l'invasion des brins pourrait représenter un moyen de contrôle pour empêcher la synthèse télomérique incontrôlée par la voie de BIR.

5. La répression du phénotype ALT dans les cellules