Différentes techniques peuvent être utilisées pour synchroniser une culture de levure à une étape précise du cycle cellulaire. Par soucis de brièveté, ne seront présentées dans cette section que les techniques de synchronisation utilisées dans la partie Résultats (Figure 13). Les équivalences de ces synchronisations dans différents organismes modèles sont reportées dans la Table I.
i. Synchronisation en G1
Dans les conditions standards utilisées en laboratoire, la levure S. cerevisiae se propage à l’état haploïde. En d’autres termes, chaque chromosome n’est présent qu’en une seule copie dans les cellules. L’état diploïde, généré par la fécondation entre deux cellules haploïdes, ne peut
s’opérer qu’entre cellules de types sexuels opposés. Les cellules de levure S. cerevisiae sont définies par deux types sexuels, ou haplotypes : MAT-a et MAT-alpha. Seule la fusion entre une cellule Mat-a et une cellule Mat-alpha est possible lors de la fécondation. Les cellules de ses deux haplotypes ne présentent pas de différences morphologiques mais se distinguent par la production de phéromones peptidiques spécifiques : le facteur-a pour les cellules Mat-a et le facteur-alpha (ci-après appelé a-facteur) pour les cellules Mat-alpha. Lorsque des cellules Mat-a sont en présence de cellules Mat-alpha, la liaison de l’a-facteur sur les cellules Mat-a provoque une inhibition des cyclines G1 et G1/S, Cln1, Cln2 et Cln3 (de même pour la liaison du facteur-a sur les cellules Mat- alpha) (Bardwell et al., 1994). En absence de ces cyclines, le point Start ne peut être franchi, les cellules se synchronisent en G1 et mettent en place les processus de fécondation (pour revue (Herskowitz, 1988), Figure 13). Elles initient une croissance polarisée dans la direction du gradient de phéromones en augmentant leur synthèse protéique et adoptent alors une morphologie caractéristique de « schmoo ». Néanmoins, la réponse des cellules aux facteurs a et a est inhibée par la protéine Bar1. Cette protéase sécrétée dans le milieu extracellulaire clive les phéromones et diminue leur concentration locale. De ce fait, la réponse aux phéromones ne peut être initiée qu’en présence d’un excès de facteurs-a ou a, outrepassant l’action de Bar1.
La communauté scientifique utilisant S. cerevisiae comme modèle d’étude a su, depuis de nombreuses années, mettre à profit ce processus physiologique. En effet, l’ajout répété d’a-facteur (permettant un excédent de phéromone et la saturation de Bar1) dans des cultures de cellules Mat-a induit l’Mat-arrêt du cycle cellulMat-aire en G1, sMat-ans inhibition du métMat-abolisme cellulMat-aire. Ce mode de synchronisation est particulièrement avantageux : il est issu d’un processus naturel ne nécessitant pas de manipulation génétique des souches de levure. De plus, l’élimination de l’a-facteur du milieu de culture permet le relargage rapide des cellules qui franchissent le point Start en quelques minutes et initient, de manière synchrone, un nouveau cycle cellulaire (Breeden, 1997).
ii. Synchronisation en G1/S
La synchronisation des cellules en G1/S s’effectue par surexpression d’une version non dégradable de la protéine CKI, Sic1 (Verma et al., 1997). Cette protéine s’accumule dans les cellules en G1 et inhibe le fonctionnement des cyclines S et M. Elle ne régule cependant pas l’activité des cyclines G1 et G1/S. Ainsi Sic1 prévient l’entrée précoce des cellules en phase S
(Lengronne and Schwob, 2002) mais n’impacte pas sur la progression en G1/S. Afin d’initier la phase S, les cyclines G1/S Cln1 et Cln2 phosphorylent Sic1, provoquant ainsi sa dégradation par le protéasome et la levée de l’inhibition des cyclines S et M.
Dans le cas où une version non dégradable de Sic1 est accumulée en G1, les cellules franchissent le point Start et expriment les cyclines G1/S. Cependant le niveau de Sic1 reste élevé dans ces cellules et ne permet pas l’entrée en phase S et l’initiation de la réplication. Les cellules sont alors synchronisées en G1/S c’est-à-dire après le point Start mais avant la phase S (Figure 13).
iii. Synchronisation en mitose, sans réplication
Les cellules peuvent également être synchronisées en phase S, avant la réplication de l’ADN. Dans ce cas, les cellules n’expriment plus les cyclines G1/S comme lors de la synchronisation avec Sic1 mais les cyclines S et M. La synchronisation à cette étape du cycle est provoquée par l’inactivation de la protéine Cdc45, une sous unité régulatrice du complexe hélicase CMG (Cdc45-7-GINS) (Zou et al., 1997). Les sous-unités catalytiques du complexe Mcm2-7 sont recrutées sur l’ADN en fin de mitose, comme composants du complexe de pré-réplication. Elles sont cependant inactives. Leur activation nécessite le recrutement, en début de phase S, des sous-unités régulatrices Cdc45 et GINS. Le complexe actif initie alors l’ouverture de la double hélice d’ADN aux origines de réplications et recrute les ADN polymérases nécessaires à la réplication de l’ADN (pour revue (Bell and Dutta, 2002)). Lorsque Cdc45 est inactivé, le complexe CMG reste inactif et les ADN polymérases ne sont pas recrutées sur l’ADN. Par conséquent, l’ADN ne peut être répliqué dans cette condition. Cependant, comme mentionné précédemment, les cyclines M sont accumulées lors de la phase S chez S. cerevisiae. Dans la condition où Cdc45 est inactivé, les cyclines M sont exprimées et l’état physiologique des cellules est comparable à celui de cellules en mitose. Toutefois l’ADN n’a pas été répliqué (Figure 13).
iv. Synchronisations en mitose
La synchronisation des cellules en métaphase peut être provoquée par plusieurs mécanismes, physiologiquement non équivalents. Une première approche consiste à tirer parti de la génétique de la levure et à inactiver conditionnellement un activateur majeur du complexe APC, la protéine Cdc20. En plus de dégrader les cyclines S et M, l’APC stimule le clivage des cohésines au début de l’anaphase (pour revue (Yu, 2007)). Ainsi lorsque Cdc20 est invalidé, l’APC est inactif
et les cohésines maintenues sur les chromosomes permettent de résister aux forces de traction exercées par les microtubules. Les cellules sont donc synchronisées en métaphase (Figure 13).
Une seconde approche consiste à ajouter dans le milieu de culture une drogue qui déstabilise des microtubules : le Nocodazole. Lorsque les cellules sont en présence de Nocodazole le fuseau mitotique ne peut être correctement assemblé, les chromosomes ne sont pas bi-orientés (Figure 13) et les cellules déclenchent le point de contrôle d’assemblage du fuseau mitotique (Figure 9). De plus les MTOC ne sont pas séparés (Jacobs et al., 1988). Ainsi l’ajout de Nocodazole dans le milieu de culture synchronise les cellules dans un état proche de celui de la prophase. Par ailleurs, il faut noter que le Nocodazole semble induire la compaction des chromosomes, à la fois chez la levure
S. cerevisiae et dans les cellules de mammifères (Choi et al., 2011; Lazar-Stefanita et al., 2017).