b) GddpaarUdT ... 129 3. Dérivés de l’ebpatcn ... 131 a) Synthèse ... 131 b) Relaxivité ... 132 4. Conclusion ... 135 5. Références ... 135
Greffage de complexes
oligonucléotides
1.
ADN
a) Généralités
L’information génétique codée de tous les êtres vivants est dans un
l’acide désoxyribonucléique ou ADN. L’ADN est un polynucléotide, macromolécule découverte grâce aux travaux de Griffith puis Avery et ses collaborateurs
élucidée par Watson et Crick en 1953,
L’ADN est une macromolécule biologique dont les unités de bases sont les nucléotides. Ils résultent de la combinaison d’un groupement phosphate, d’un pentose (le 2
azotée à noyau purique (adénine, guanine) ou pyrimidique (thymine, cytosine) désignée par les lettres A, G, T et C (figure IV-1).
phosphorylation de l’hydroxyle en position 5’ du sucr
formé par des nucléotides liés entre eux par une liaison phosphodiester entre l’extrémité 5’ et 3’ des sucres portés par deux nucléotides adjacents. Chaque brin d’ADN est chargé négativement.
De part leur structure, les bases azotées ont la propriété de former des liaisons hydrogène entre elles de façon spécifique. L’adénine se lie à la thymine par deux liaisons hydrogène, l’association guanine cytosine en fait intervenir trois. Cet appariement exclusif entre b
de deux brins d’ADN liés par des liaisons hydrogène. L’assemblage de deux brins conduit à la formation d’un édifice chimique dont la structure est une double hélice d’un diamètre constant de 2 nm. L’hélice formée comporte deux zones d’enroulement distincts
IV-1). L’orientation d’un brin est de 5’phosphate vers 3’OH pour l’un des brins et de 3’OH vers 5’phosphate pour l’autre ; on dit qu’ils sont antiparallèles.
Figure IV-1 : Structure de la molécule d’ADN et a
121
Greffage de complexes de lanthanides sur les
L’information génétique codée de tous les êtres vivants est dans un langage universel au sein de l’acide désoxyribonucléique ou ADN. L’ADN est un polynucléotide, macromolécule découverte grâce aux travaux de Griffith puis Avery et ses collaborateurs1 et dont la structure en double hélice a été élucidée par Watson et Crick en 1953,2 leur valant le prix Nobel en 1962.
L’ADN est une macromolécule biologique dont les unités de bases sont les nucléotides. Ils résultent de la combinaison d’un groupement phosphate, d’un pentose (le 2-désoxy-D-ribose) et
azotée à noyau purique (adénine, guanine) ou pyrimidique (thymine, cytosine) désignée par les 1). On appelle un nucléoside une base substituée par un sucre. La phosphorylation de l’hydroxyle en position 5’ du sucre donne un nucléotide. Chaque brin d’ADN est formé par des nucléotides liés entre eux par une liaison phosphodiester entre l’extrémité 5’ et 3’ des sucres portés par deux nucléotides adjacents. Chaque brin d’ADN est chargé négativement.
ture, les bases azotées ont la propriété de former des liaisons hydrogène entre elles de façon spécifique. L’adénine se lie à la thymine par deux liaisons hydrogène, l’association guanine cytosine en fait intervenir trois. Cet appariement exclusif entre bases azotées conduit à l’association de deux brins d’ADN liés par des liaisons hydrogène. L’assemblage de deux brins conduit à la formation d’un édifice chimique dont la structure est une double hélice d’un diamètre constant de 2 rte deux zones d’enroulement distincts : un petit et un grand sillon (figure 1). L’orientation d’un brin est de 5’phosphate vers 3’OH pour l’un des brins et de 3’OH vers
; on dit qu’ils sont antiparallèles.
Structure de la molécule d’ADN et association des bases azotées complémentaires
sur les
langage universel au sein de l’acide désoxyribonucléique ou ADN. L’ADN est un polynucléotide, macromolécule découverte grâce et dont la structure en double hélice a été
L’ADN est une macromolécule biologique dont les unités de bases sont les nucléotides. Ils résultent ribose) et d’une base azotée à noyau purique (adénine, guanine) ou pyrimidique (thymine, cytosine) désignée par les On appelle un nucléoside une base substituée par un sucre. La e donne un nucléotide. Chaque brin d’ADN est formé par des nucléotides liés entre eux par une liaison phosphodiester entre l’extrémité 5’ et 3’ des sucres portés par deux nucléotides adjacents. Chaque brin d’ADN est chargé négativement.
ture, les bases azotées ont la propriété de former des liaisons hydrogène entre elles de façon spécifique. L’adénine se lie à la thymine par deux liaisons hydrogène, l’association guanine-
ases azotées conduit à l’association de deux brins d’ADN liés par des liaisons hydrogène. L’assemblage de deux brins conduit à la formation d’un édifice chimique dont la structure est une double hélice d’un diamètre constant de 2 : un petit et un grand sillon (figure 1). L’orientation d’un brin est de 5’phosphate vers 3’OH pour l’un des brins et de 3’OH vers
La structure en double hélice de l’ADN, appelée conformation B, est une des structures polymorphes de l’ADN existant dans le vivant. On en dén
Les différents polymorphes de l’ADN sont caractérisés par leur structure, leur sens d’enroulement et le pas d’enchainement des bases. Trois des 21 conformations sont majoritaires dans le vivant conformation B, la conformation A (hélice droite) et la conformation Z (enroulement gauche en zigzag). On peut également retrouver des structures tertiaires du type triplex ou quadruplex. Une structure de type triplex est composée d’une molécule d’ADN bi
brin s’apparie par l’intermédiaire du grand sillon
palindromes, des répétitions inversées ou en miroir des bases, peut produire des structures cruciformes ou en épingle à cheveux
La succession de bases guanine permet la formation de liaisons hydrogène entre 4 bases appariement forme un quartet plan de guanine. Ces quartets sont stabilisés par la présence d’un cation, souvent le sodium, encapsulé
parallèlement pour former un G
Figure IV-2 : Liaisons hydrogène dans un G
Dans la cellule eucaryote, l’ADN est contenu dans le noyau. Il est associé à des protéines, les histones, autour desquelles il s’enroule formant une substance visqueuse appelée chromatine. Chaque segment d’ADN enroulé sur ses histones forme un nucléosome. L’assemb
s’enroule à nouveau sur lui-même pour former une structure plus compacte appelée chromosome. Le nombre de chromosomes par cellule est caractéristique d’une espèce. Par exemple, les cellules humaines contiennent 2x23 chromosomes diploïdes c
Malgré cet énorme degré de compaction, l’ADN doit être rapidement accessible afin de permettre son interaction avec la machinerie cellulaire et assurer le transfert de l’information génétique selon le processus : réplication, transcription et tradu
étapes peut entrainer de graves conséquences cancers.
L’ADN possède une réactivité non négligeable vis
processus comme l’hydrolyse, l’oxydation, l’alkylation, des réactions photochimiques, les radiations ionisantes peuvent endommager la molécule d’ADN. Les lésions qui en résultent ont des conséquences directes sur la réplication et la transcription. Heureuse
divers moyens pour prévenir la formation des dommages et pour réparer l’ADN en cas de lésions.
122
La structure en double hélice de l’ADN, appelée conformation B, est une des structures polymorphes de l’ADN existant dans le vivant. On en dénombre 21, chacune désignée par une lettre de l’alphabet. Les différents polymorphes de l’ADN sont caractérisés par leur structure, leur sens d’enroulement et le pas d’enchainement des bases. Trois des 21 conformations sont majoritaires dans le vivant conformation B, la conformation A (hélice droite) et la conformation Z (enroulement gauche en zigzag). On peut également retrouver des structures tertiaires du type triplex ou quadruplex. Une omposée d’une molécule d’ADN bicaténaire autour duquel un troisième brin s’apparie par l’intermédiaire du grand sillon via des liaisons hydrogène. La présence de palindromes, des répétitions inversées ou en miroir des bases, peut produire des structures cruciformes ou en épingle à cheveux, par appariement intra-brin.
La succession de bases guanine permet la formation de liaisons hydrogène entre 4 bases appariement forme un quartet plan de guanine. Ces quartets sont stabilisés par la présence d’un cation, souvent le sodium, encapsulé au centre du quartet de guanine. Ces quartets s’empilent parallèlement pour former un G-quadruplex d’ADN (figure IV-2).
: Liaisons hydrogène dans un G-quartet et structure intramoléculaire
cellule eucaryote, l’ADN est contenu dans le noyau. Il est associé à des protéines, les histones, autour desquelles il s’enroule formant une substance visqueuse appelée chromatine. Chaque segment d’ADN enroulé sur ses histones forme un nucléosome. L’assemb
même pour former une structure plus compacte appelée chromosome. Le nombre de chromosomes par cellule est caractéristique d’une espèce. Par exemple, les cellules humaines contiennent 2x23 chromosomes diploïdes chacune.
Malgré cet énorme degré de compaction, l’ADN doit être rapidement accessible afin de permettre son interaction avec la machinerie cellulaire et assurer le transfert de l’information génétique selon : réplication, transcription et traduction. Une seule perturbation au cours de ces trois étapes peut entrainer de graves conséquences : maladies génétiques, congénitales ou encore des
L’ADN possède une réactivité non négligeable vis-à-vis d’agents endogènes et exogènes. Différents rocessus comme l’hydrolyse, l’oxydation, l’alkylation, des réactions photochimiques, les radiations ionisantes peuvent endommager la molécule d’ADN. Les lésions qui en résultent ont des conséquences directes sur la réplication et la transcription. Heureusement les cellules disposent de divers moyens pour prévenir la formation des dommages et pour réparer l’ADN en cas de lésions. La structure en double hélice de l’ADN, appelée conformation B, est une des structures polymorphes ombre 21, chacune désignée par une lettre de l’alphabet. Les différents polymorphes de l’ADN sont caractérisés par leur structure, leur sens d’enroulement et le pas d’enchainement des bases. Trois des 21 conformations sont majoritaires dans le vivant : la conformation B, la conformation A (hélice droite) et la conformation Z (enroulement gauche en zigzag). On peut également retrouver des structures tertiaires du type triplex ou quadruplex. Une ténaire autour duquel un troisième des liaisons hydrogène. La présence de palindromes, des répétitions inversées ou en miroir des bases, peut produire des structures
La succession de bases guanine permet la formation de liaisons hydrogène entre 4 bases : cet appariement forme un quartet plan de guanine. Ces quartets sont stabilisés par la présence d’un au centre du quartet de guanine. Ces quartets s’empilent
quartet et structure intramoléculaire des G quadruplex
cellule eucaryote, l’ADN est contenu dans le noyau. Il est associé à des protéines, les histones, autour desquelles il s’enroule formant une substance visqueuse appelée chromatine. Chaque segment d’ADN enroulé sur ses histones forme un nucléosome. L’assemblage ADN-histone même pour former une structure plus compacte appelée chromosome. Le nombre de chromosomes par cellule est caractéristique d’une espèce. Par exemple, les cellules
Malgré cet énorme degré de compaction, l’ADN doit être rapidement accessible afin de permettre son interaction avec la machinerie cellulaire et assurer le transfert de l’information génétique selon ction. Une seule perturbation au cours de ces trois : maladies génétiques, congénitales ou encore des
vis d’agents endogènes et exogènes. Différents rocessus comme l’hydrolyse, l’oxydation, l’alkylation, des réactions photochimiques, les radiations ionisantes peuvent endommager la molécule d’ADN. Les lésions qui en résultent ont des ment les cellules disposent de divers moyens pour prévenir la formation des dommages et pour réparer l’ADN en cas de lésions.
Chez les mammifères, on distingue six voies de réparation de l’ADN possédant un mécanisme qui lui est propre : la réparation par réversion directe, par excision de base, par excision de nucléotides, par recombinaison homologue, par suture des extrémités et enfin la réparation des mésappariements. Comprendre comment interagit l’ADN avec les protéines ou divers agents exogènes au nive moléculaire est essentiel pour permettre le développement de nouveaux candidats médicaments ainsi que de nouveaux outils de diagnostic performant
une détection plus tôt de certaines maladies comme les tumeur nous intéressons à ces outils mettant en jeu
exemples issus de la littérature.
b) Sondes ADN-complexes de lanthanide
Comme il a été vu dans l’introduction, lier un
de ralentir le temps de corrélation rotationnelle et donc d’optimiser la relaxivité. L’étude des interactions de l’ADN avec des éléments endogènes et exogènes permet d’étudier les niveaux d’expression des gènes, l’identification des virus et bactéries pathogènes ou encore des troubles génétiques. Des sondes ADN sont alors conçues pour pouvoir détecter ces interactions notamment grâce à l'IRM ou l'imagerie optique. Deux exemples très récents utilisent les com
lanthanides pour quantifier l’ADN.
permet également d’optimiser la relaxivité. Dans cette partie deux catégories d’interaction avec l’ADN mettant en jeu des complexes de gadolinium dans la littérature vont être présentées d’abord l’interaction non covalente et le greffage covalent des complexes sur des séquences d’ADN. Toutes deux ont le même objectif, la conception de sondes ADN pour comprendre
avec le milieu endogène ou exogène.
• Interaction non covalente
Différentes interactions sont mises en œuvre pour la conception de sondes ADN de façon non covalente. Elles peuvent mettre en jeu des liaisons hydrogène, électrostatiques, de coordination ou de π- stacking. Elles déterminent la voie de reconnaissance de l’ADN, par le grand sillon, le petit sillon ou par un phénomène d’intercalation entre les paires de bases de l’ADN.
Peu de complexes de gadolinium
covalente. Le premier exemple décrit par le groupe de Caravan consiste en l’interaction non covalente d’un peptide de type HTH (helix
IV-3).5 Les études de relaxivité montrent une augmentation de 21.2 à 42.4 présence d’un équivalent d’ADN.
Figure IV-3 : Représentation de l’interaction du peptide HTH complexé avec du Gd(III) avec l’ADN
123
Chez les mammifères, on distingue six voies de réparation de l’ADN possédant un mécanisme qui lui réversion directe, par excision de base, par excision de nucléotides, par recombinaison homologue, par suture des extrémités et enfin la réparation des mésappariements. Comprendre comment interagit l’ADN avec les protéines ou divers agents exogènes au nive moléculaire est essentiel pour permettre le développement de nouveaux candidats médicaments ainsi que de nouveaux outils de diagnostic performants. Ces outils de diagnostic peuvent permettre une détection plus tôt de certaines maladies comme les tumeurs. Dans le cadre de ce chapitre, nous
mettant en jeu sur des complexes de lanthanides d'abord
complexes de lanthanides
Comme il a été vu dans l’introduction, lier un complexe de gadolinium à une macromolécule permet de ralentir le temps de corrélation rotationnelle et donc d’optimiser la relaxivité. L’étude des interactions de l’ADN avec des éléments endogènes et exogènes permet d’étudier les niveaux ènes, l’identification des virus et bactéries pathogènes ou encore des troubles génétiques. Des sondes ADN sont alors conçues pour pouvoir détecter ces interactions notamment grâce à l'IRM ou l'imagerie optique. Deux exemples très récents utilisent les com
lanthanides pour quantifier l’ADN.3,4 L’incorporation de ces complexes sur la macromolécule d’ADN,
permet également d’optimiser la relaxivité. Dans cette partie deux catégories d’interaction avec complexes de gadolinium dans la littérature vont être présentées d’abord l’interaction non covalente et le greffage covalent des complexes sur des séquences d’ADN. Toutes deux ont le même objectif, la conception de sondes ADN pour comprendre
avec le milieu endogène ou exogène.
Interaction non covalente
Différentes interactions sont mises en œuvre pour la conception de sondes ADN de façon non covalente. Elles peuvent mettre en jeu des liaisons hydrogène, électrostatiques, de coordination ou stacking. Elles déterminent la voie de reconnaissance de l’ADN, par le grand sillon, le petit sillon ou par un phénomène d’intercalation entre les paires de bases de l’ADN.
Peu de complexes de gadolinium sont conçus dans le but d’interagir avec l’ADN de
covalente. Le premier exemple décrit par le groupe de Caravan consiste en l’interaction non covalente d’un peptide de type HTH (helix-turn-helix) complexé par un ion Gd(III) avec l’ADN (figure
Les études de relaxivité montrent une augmentation de 21.2 à 42.4 mM présence d’un équivalent d’ADN.
Représentation de l’interaction du peptide HTH complexé avec du Gd(III) avec l’ADN Chez les mammifères, on distingue six voies de réparation de l’ADN possédant un mécanisme qui lui
réversion directe, par excision de base, par excision de nucléotides, par recombinaison homologue, par suture des extrémités et enfin la réparation des mésappariements. Comprendre comment interagit l’ADN avec les protéines ou divers agents exogènes au niveau moléculaire est essentiel pour permettre le développement de nouveaux candidats médicaments
. Ces outils de diagnostic peuvent permettre s. Dans le cadre de ce chapitre, nous sur des complexes de lanthanides d'abord à travers des
complexe de gadolinium à une macromolécule permet de ralentir le temps de corrélation rotationnelle et donc d’optimiser la relaxivité. L’étude des interactions de l’ADN avec des éléments endogènes et exogènes permet d’étudier les niveaux ènes, l’identification des virus et bactéries pathogènes ou encore des troubles génétiques. Des sondes ADN sont alors conçues pour pouvoir détecter ces interactions notamment grâce à l'IRM ou l'imagerie optique. Deux exemples très récents utilisent les complexes de L’incorporation de ces complexes sur la macromolécule d’ADN, permet également d’optimiser la relaxivité. Dans cette partie deux catégories d’interaction avec complexes de gadolinium dans la littérature vont être présentées : tout d’abord l’interaction non covalente et le greffage covalent des complexes sur des séquences d’ADN. Toutes deux ont le même objectif, la conception de sondes ADN pour comprendre les interactions
Différentes interactions sont mises en œuvre pour la conception de sondes ADN de façon non covalente. Elles peuvent mettre en jeu des liaisons hydrogène, électrostatiques, de coordination ou stacking. Elles déterminent la voie de reconnaissance de l’ADN, par le grand sillon, le petit sillon
conçus dans le but d’interagir avec l’ADN de façon non covalente. Le premier exemple décrit par le groupe de Caravan consiste en l’interaction non helix) complexé par un ion Gd(III) avec l’ADN (figure mM-1s-1 à 60 MHz en
Le second exemple est un agent qui s’intercale dans l’ADN grâce à un noyau aromatique, le thiazole orange, fonctionnalisé par le complexe GdDTPA
Après ajout d’ADN la relaxivité augmente de 4.23 à 6.5
la relaxivité est faible dans ce cas à cause de la flexibilité de l’espaceur qui engendre une rotation du complexe quasiment indépendante de celle de l’adduit ADN
exemple décrit par le groupe de Pope, montre l’utilisation de deux complexes dérivés du DOTA liés entre eux par un noyau anthraquinone connu pour être un intercalant de l’ADN (figure IV
travail montre une augmentation de la relaxivité de 5.4 à 11.7 d’ADN, significatif d’un système tournant lentement.
Figure IV-4 : Complexes de Gd(III) fonctionnalisés avec des intercalants de l’ADN
• Greffage sur l’ADN
La seconde stratégie pour la conception de sondes ADN est de greffer de manière covalente les complexes de gadolinium sur l’ADN. La
aptamères. Les aptamères sont des courtes séquences d’ADN ou d’ARN capables de se lier spécifiquement à une cible avec une haute affinité. Ils sont obtenus par un processus de screening appelé "systematic evolution of ligands by exponential enri
ou ARN allant jusqu’à 105 séquences et des cibles allant des petites molécules aux protéines.
fonctionnalisation des aptamères avec des complexes de gadolinium permet d’optimiser à la fois les propriétés pharmacocinétiques des agents de contraste (en ciblant spécifiquement une protéine ou des cellules) et leurs propriétés relaxométriques (par effet de taille ou par effet de structure).
Par exemple, la fonctionnalisation du complexe GdDTPA avec un oligonucléotide de 6
IV-5) permet de cibler le 5S rARN par complémentarité de séquence dans le but de cibler les séquences ARN surexprimées dans les cellules cancéreuses.
de la relaxivité du complexe GdDTPA lié à l’oligonucléotide de 4.3 à 8.8
est observée. Lors de la liaison de l’aptamère à sa cible, une augmentation supplémentaire de 16% de la relaxivité est observée due à l’augmentation de la taille du système.
Figure IV-5 : Fonctionnalisation d’
A
124
Le second exemple est un agent qui s’intercale dans l’ADN grâce à un noyau aromatique, le thiazole orange, fonctionnalisé par le complexe GdDTPA via un espaceur aminohexanoate (figure IV Après ajout d’ADN la relaxivité augmente de 4.23 à 6.5 mM-1s-1 à 20 MHz et 37°C. L’augmentation de