Trem-1 est exprimé par les cellules endothéliales
microvasculaires pulmonaires humaines (HPMEC)
Les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines (HPMEC) sont des cellules
primaires isolées du poumon à partir d'un seul donneur. Les cellules sont systématiquement
analysées par coloration immunofluorescente par le fournisseur (PromoCell, Heidelberg,
Germany) : elles sont positives pour le marqueur CD31 (Platelet endothelial cell adhesion
molecule -1, PECAM-1) et pour le facteur von Willebrand (vWF) et négatives pour
l'alpha-actine des muscles lisses.
L'expression de Trem-1 dans les HPMEC a dans un premier temps été analysée par qRT-PCR.
On remarque que Trem-1 est très faiblement exprimé au niveau basal (contrôle), mais suite à
une stimulation avec du LPS (10µg/mL) on observe une augmentation significative de
l'expression de Trem-1 avec un pic atteint après 6 heures de stimulation (Figure 23A).
L'addition de LR12 (50µg/mL), un dodécapeptide synthétique inhibiteur TREM-1, amorti cette
régulation positive de TREM-1 induite par LPS.
Pour confirmer ces résultats, l'expression TREM-1 a été analysée par cytométrie en flux
(Figure 23B, C). La stimulation par LPS a induit une augmentation du pourcentage de cellules
positives pour TREM-1 de façon dépendante du temps de stimulation avec également un pic
après 6 heures de stimulation. Le niveau d'expression (intensité de fluorescence moyenne) a
également été augmenté suite à la stimulation par LPS. Le LR12 réduit de façon significative
l’expression de TREM-1 après 3 heures et 6 heures de stimulation. Le LR12 ne présente plus
d’effets après 12 heures de stimulation.
Afin de connaitre la localisation cellulaire de TREM-1 dans les HPMEC, les cellules ont été
marquées pour le facteur von Willebrand (vWF) et pour le noyau à l’aide du TO-PRO3 ainsi
que pour TREM-1 (Figure 24). TREM-1 n'a pas été observé dans les cellules non stimulées
(panel supérieur). Le LPS induit une expression de TREM-1 qui semble être co-localisée avec
le facteur Von Willebrand dans les HPMEC (panel inférieur).
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Figure 23 : Trem-1 est exprimé par les cellules endothéliales
microvasculaires pulmonaires humaines (HPMEC)
(A) Quantification par qRT-PCR de l’expression génique de Trem-1 dans les HPMEC au cours du temps après stimulation par LPS (10µg/mL) en présence ou non de LR12 (50µg/mL), n= 5 par condition, # P<0,05 contrôle vs LPS; *P< 0,05, **P<0,01 LPS vs LPS + LR12 ( t test). (B) Analyse par cytométrie en flux de l’expression de TREM-1 dans les HPMEC au cours du temps après stimulation par LPS (10µg/mL) en présence ou non de LR12 (50µg/mL). Les résultats présentent le pourcentage de cellules positives pour TREM-1 (panel de gauche) ou le taux d’expression de TREM-1 par rapport au contrôle (fold increase) (panel de droite), n=3 par condition, # P<0,05 contrôle vs LPS; *P< 0,05, **P<0,01 LPS vs LPS + LR12 (t test). (C) Histogramme représentatif de l’expression de TREM-1 dans les HPMEC dans les trois groupes aux temps indiqués.
85
Figure 24 : Trem-1 est exprimé par les cellules endothéliales
microvasculaires pulmonaires humaines (HPMEC)
Images de microscopie confocale des HPMEC non stimulées (panel du haut) et stimulées au LPS (10µg/mL) (panel du bas). Les cellules ont été marquées pour TREM-1, le facteur von Willebrand (vWF) et TO-PRO3, échelle = 50µm. Images représentatives de 3 expériences distinctes.
86
L’ensemble de ces résultats obtenus à l‘aide de trois techniques différentes permet de
conclure que Trem-1 est exprimé in vitro par les cellules endothéliales microvasculaires
pulmonaires humaines suite à une stimulation par LPS.
Trem-1 est exprimé par l'endothélium vasculaire
Pour confirmer l'expression de TREM-1 par les cellules endothéliales, nous avons étudié son
expression par qRT-PCR dans des aortes et des artères mésentériques prélevées chez des
souris WT saines. Ces vaisseaux, une fois prélevés, ont été stimulés ex vivo avec du LPS
(10µg/mL) pendant 6 heures. L'expression de Trem-1 est très faible dans les vaisseaux non
stimulés mais suite à la stimulation par LPS on observe une augmentation significative de
l’expression de Trem-1 à la fois dans les aortes (Figure 25A) et dans les artères mésentériques
(Figure 25B). On remarque de façon très intéressante que lorsque les aortes ont été
préalablement désendothélialisées, l’expression de Trem-1 disparait. Ce dernier résultat
permet ainsi de conclure que l’expression de Trem-1 par les vaisseaux est porté par les cellules
endothéliales et non par les cellules musculaires lisses ou autres composants de la paroi
vasculaire (Figure 25A). Ces résultats ont été confirmés par microscopie confocale (Figure
25C).
Dans un deuxième temps, des aortes et des artères mésentériques de souris ont été prélevées
18 heures après induction d’un choc septique par ligature et perforation caecale (CLP). Les
mêmes résultats que précédemment ont été observés au niveau aortique et mésentérique :
Trem-1 est up-régulé dans les aortes et les artères mésentériques prélevées 18 heures après
la CLP (Figure 26A, B). L’injection de LR12 2 heures après la chirurgie diminue de façon
significative l’expression de Trem-1.
L’analyse par microscopie confocale des poumons de souris contrôles et septiques (CLP)
révèle que l'expression de TREM-1 est faible chez les animaux sains, mais que celle-ci
augmente fortement au cours du choc septique (Figure 26C).
Ces données expérimentales nous permettent de conclure que :
- TREM-1 est exprimé in vivopar l’endothélium vasculaire, son expression s’accroit au
cours du sepsis expérimental chez la souris
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Figure 25 : Le LPS induit l’expression de Trem-1 par l’endothélium
vasculaire
Des anneaux aortiques (A) ou mésentériques (B) de souris saines ont été prélevés, nettoyés et stimulés pendant 24h avec du LPS (10µg/mL). L’endothélium aortique a été retiré (+Endo) ou non (-Endo) et l’expression génique
de Trem-1 a été déterminée par qRT-PCR, n=6 par groupe, *** P<0,005 (t test). (C) Images de microscopie
confocale d’aortes des souris saines contrôles (panel du haut) et des souris saines stimulées pendant 24h avec du LPS (10µg/mL) (panel du bas). Ces vaisseaux ont été marqués pour TREM-1, et TO-PRO3, échelle = 50µm. Images représentatives de 3 expériences distinctes.
A B
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Figure 26 : Trem-1 est exprimé in vivo par l'endothélium vasculaire
Quantification par qRT-PCR de l’expression génique de Trem-1 dans les aortes (A) et les artères mésentériques (B) des souris contrôles, septiques (CLP) et septiques traitées par LR12 (CLP LR12) (5mg/kg IP, 1 heure après la CLP), n=6 par groupe, **P<0,01 (t test). (C) Images de microscopie confocale des poumons des souris contrôles (panel du haut) et des souris septiques (CLP) (panel du bas). Les poumons ont été marqués pour TREM-1, cadhérine 5 et TO-PRO3, échelle = 50µm. Images représentatives de 3 expériences distinctes.
89
La modulation de TREM-1 inhibe la dysfonction vasculaire
induite par le LPS
Nous avons par la suite examiné la fonction du TREM-1 endothélial. Pour cela, des aortes de
souris WT saines ont été prélevées afin d’étudier la réponse contractile à la phényléphrine et
la relaxation à l’acétylcholine après stimulation avec du LPS et un anticorps monoclonal
agoniste de TREM-1. Comme attendu, l'incubation des anneaux aortiques avec du LPS
pendant 4 heures a altéré la contractilité et la relaxation (Figure 27A). Le LPS induit une
hyporeactivité vasculaire et une atteinte de la relaxation endothélium dépendante. La
co-incubation avec le peptide LR12 a pratiquement restauré la réponse contractile à la
phényléphrine et la relaxation à l’acéthylcholine. En revanche, l'activation du TREM-1
endothélial, induite par la stimulation des anneaux aortiques avec un anticorps monoclonal
agoniste de TREM-1 (αTREM-1), entraîne une diminution de la contractilité et de la relaxation
semblable à celle obtenue avec le LPS. La stimulation avec un anticorps isotypique contrôle
n’a aucun effet. Ces données suggèrent que l'engagement de TREM-1 (induit par le LPS ou par
l’anticorps agonistique) altère la réactivité vasculaire.
Pour évaluer les effets du peptide LR12 sur les HPMEC stimulées au LPS, la production de NO,
s-ICAM-1, s-E-sélectine et IL-6 a été mesuré. La stimulation par LPS induit une production
accrue de NO, s-ICAM-1, s-E-sélectine et IL-6 qui a été partiellement réduite par LR12 (Figure
27B-27E).
Une analyse de la cinétique d’expression des protéines de signalisation dans les HPMEC a
révélé une augmentation de la phosphorylation de ERK1/2, Akt, p38 et p65 et une
augmentation de l'expression de COX-2 suite à la stimulation par LPS. Le traitement par LR12
réduit l’expression de ces différentes protéines (Figure 27F).
Au-delà d'être responsable du maintien de la réactivité vasculaire, l'endothélium est aussi
impliqué dans le trafic de leucocytes. En effet, à la suite de leur adhérence aux cellules
endothéliales, les leucocytes sanguins traversent la paroi des vaisseaux pour se retrouver sur
le site même de l'inflammation. Nous avons pour cela étudié l’adhésion de monocytes sur une
couche de cellules endothéliale (HMPEC) en condition de flux. Deux lignées de cellules
monocytaires ont été utilisées : la lignée U937 qui exprime très faiblement TREM-1 et la lignée
U937-TD qui sur-exprime TREM-1
142. On remarque que peu de cellules U937 adhèrent aux
cellules endothéliales en condition basale. En revanche suite à la stimulation par TNFα le
90
Figure 27 : La modulation de TREM-1 inhibe in vitro la dysfonction
vasculaire induite par le LPS
(A) Des anneaux aortiques issus de souris WT saines ont été prélevés, nettoyés et stimulés pendant 4 heures avec du LPS (10µg/mL), l’anticorps monoclonal agoniste de TREM-1 (αTREM-1) (5µg/mL) ou du LR12 (20µg/mL) afin d’étudier la réponse à la phényléphrine (Phe) (panel de gauche) et la réponse à l’acétylcholine (Ach) (panel de droite), n=5 par groupe, *P< 0,05, **P<0,01, *** P<0,005 (Two-way ANOVA). (B) Les taux de NO intracellulaire produits dans les HPMEC ont été déterminés par cytométrie en flux après stimulation pendant 24 heures par LPS (10µg/mL) en présence ou non de LR12 (50µg/mL), n=3 par condition, *P< 0,05, **P<0,01 (t test). Quantification par ELISA des taux d’IL-6 (C), s-ICAM-1 (D) et s-Esélectine (E) dans les surnageants de culture des HPMEC après 24 heures de stimulation par LPS (10µg/mL) en présence ou non de LR12 (50µg/mL), n=6 par condition, *P< 0,05, **P<0,01, *** P<0,005 (t test). (F) Analyse par Western Blot des voies de signalisation dans les HPMEC après 3, 10, 30 et 60 minutes de stimulation par LPS (10µg/mL) en présence ou non de LR12 (50µg/mL), Blots représentatifs de 3 expériences.
91
nombre de monocytes adhérents augmente (Figure 28). L'adhésion des monocytes est encore
plus marquée lorsque l'on utilise des cellules U937-TD. Cette approche nous permet de
conclure que la surexpression TREM-1 sur les cellules U937 favorise l'adhésion aux cellules
endothéliales.
L’ensemble de ces résultats indique un rôle de TREM-1 dans l'activation de l'endothélium et
la réactivité vasculaire.
L'inhibition de TREM-1 protège les souris de la dysfonction
vasculaire induite par le choc septique
Nous avons ensuite étudié l’effet du traitement par LR12 sur la réponse contractile à la
phényléphrine ainsi que sur la relaxation à l’acétylcholine endothélium dépendante au niveau
d’anneaux issus d’aortes thoraciques et d’artères mésentériques de souris ayant subi un choc
septique par péritonite (CLP).
Nous constatons que la réponse contractile à la phényléphrine des vaisseaux aortiques et
mésentérique est significativement réduite chez les souris septiques (CLP) par rapport aux
souris saines (contrôles). On observe également que la relaxation endothélium dépendante
induite par l’acétylcholine est sévèrement altérée chez les souris septiques par rapport aux
souris saines. Il y a donc une altération de la réactivité vasculaire avec une moindre sensibilité
aux catécholamines et une dysfonction endothéliale ce qui se traduit par une hyporeactivité
vasculaire et une atteinte de la relaxation endothélium dépendante au cours du sepsis. Ces
phénomènes sont caractéristiques de la dysfonction vasculaire observée au cours du sepsis.
Après traitement par LR12, la réponse contractile à la phényléphrine et la relaxation à
l’acéthylcholine au niveau aortique et mésentérique sont améliorées (Figure 29A).
Nous avons également étudié l’impact de l’administration du LR12 sur la réponse
inflammatoire au niveau vasculaire en s’intéressant plus particulièrement à l’expression
génique de trois cytokines inflammatoires :
- TNFα : cytokine pro-inflammatoire d’expression précoce
- IL-6 : cytokine pro-inflammatoire d’expression secondaire
92
Figure 28 : La surexpression de TREM-1 sur les cellules U937 favorise
l'adhésion aux cellules endothéliales
Analyse de l’adhésion des cellules U937 et U937-TD sur une couche de cellule endothéliales (HPMEC) dans des conditions de flux constant (0,5 dyne·cm–2 pendant 3 minutes). Les cellules endothéliales ont été stimulées ou non par du TNFα (10ng/mL) pendant 2 heures. Images représentatives de 3 champs microscopiques pour chaque condition, le nombre de cellules adhérées a été calculé et analysé, n=3 par condition, *P< 0,05 (t test).
93
On observe les mêmes résultats au niveau aortique qu’au niveau mésentérique par rapport
au profil d’expression de ces trois gènes. (Figure 29B, C)
Nous remarquons une augmentation significative de l’expression génique de Tnfα, Il-10 et
Il-6 chez les souris malades (CLP) par rapport aux souris saines (contrôles). Le choc septique
induit une réponse inflammatoire vasculaire massive comme en témoignent la surexpression
de ces gènes pro et anti-inflammatoires. En revanche, il existe une diminution significative de
l’expression de Tnfα, Il-10 et Il-6 lorsque les souris malades ont été traitées par LR12 (CLP
LR12) par rapport aux souris malades (CLP).
Au cours du choc septique, il a été démontré une atteinte de la synthèse et de la production
de certaines protéines constitutives et une surexpression de protéines inductibles. Les deux
voies de signalisation les plus impliquées sont la voie des NOS (PI3K/Akt/eNOS) et des
cyclooxygénases (COX-1, COX-2)
145,146. Que ce soit au niveau aortique ou au niveau
mésentérique, on observe dans le groupe CLP, une diminution de l'expression des protéines
constitutives p-Akt et COX-1 par rapport aux animaux témoins. Le traitement par LR12
restaure l'expression de ces deux protéines (Figure 30A, B). Parallèlement, nous avons
quantifié l'expression des protéines inductibles (iNOS, COX-2). Le choc septique induit une
augmentation de l'expression de ces protéines, et ce phénomène est atténué par LR12.
L'inhibition pharmacologique de TREM-1 par l’utilisation du peptide LR12 permet donc de
prévenir de l'inflammation et la dysfonction vasculaire induit par un choc septique en :
- Améliorant la réponse contractile et relaxante ex vivo
- Modulant la réponse inflammatoire au niveau aortique et mésentérique
Cet effet bénéfique passe vraisemblablement par la modulation de la voie de TREM-1 et peut
être le reflet d’une action directe sur l’endothélium.
La délétion de Trem-1 au niveau endothélial protège les souris
contre le choc septique
Pour répondre à cette question des souris délétées pour le gène Trem-1 au niveau endothélial
(EndoTrem-1
-/-)ont été utilisées. Nous avons étudié dans un premier temps l’effet de la
délétion de Trem-1 au niveau endothélial sur la réponse contractile à la phényléphrine ainsi
94
Figure 29 : L'inhibition pharmacologique de TREM-1 protège les souris de la
dysfonction et de l’inflammation vasculaire induite par le choc septique
(A) Etude de la réponse à la phényléphrine (Phe) (panel du haut) et de la réponse à l’acétylcholine (Ach) (panel du bas) au niveau d’anneaux aortiques et mésentériques de souris contrôles, septiques (CLP) et septiques traitées par LR12 (CLP LR12), n=7-9 par groupe de souris, *P< 0,05, **P<0,01, *** P<0,005 (Two-way ANOVA). Quantification par qRT-PCR de l’expression génique de Tnfα, Il-10 and Il-6 dans les aortes (B) et les artères mésentériques (C) des trois groupes de souris, n=6 par groupe, **P<0,01, *** P<0,005 (t test).
95
Figure 30 : L'inhibition pharmacologique de TREM-1 module les signaux
intracellulaires impliqués dans la dysfonction vasculaire induite par le choc
septique
Analyse par Western Blot de l’expression de (p)Akt, iNOS, COX-1 et COX-2 au cours du choc septique au niveau de l’aorte (A) et de l’artère mésentérique (B) des souris contrôles, septiques (CLP) et septiques traitées par LR12 (CLP LR12) 24 heures après la CLP, blots représentatifs en dessous de chaque histogramme, n=6 par groupe, *P< 0,05, *** P<0,005 (t test).
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thoraciques et d’artères mésentériques de souris ayant subi un choc septique par péritonite
(CLP). Comme attendu, on observe une hyporeactivité vasculaire et une atteinte de la
relaxation endothélium dépendante chez les souris WT septiques (CLP) (Figure 31A). On
observe que la relaxation à l’acéthylcholine au niveau aortique et mésentérique est préservée
après la CLP chez les souris EndoTrem-1
-/-. En revanche, la réponse contractile à la
phényléphrine est identique chez les souris WT et EndoTrem-1
-/-septiques. L’abolition
sélective de Trem-1 au niveau endothélial restore la relaxation endothélium dépendante donc
atténue la dysfonction endothéliale induite par le choc septique. Ces résultats indiquent, pour
la première fois, un rôle du TREM-1 endothélial dans la relaxation vasculaire.
Les concentrations de sTREM-1, un marqueur soluble de l’activation de TREM-1, ont été
mesurées par ELISA dans le plasma, le poumon et le liquide péritonéal des différents groupes
de souris. On observe une nette augmentation de sTREM-1 dans le plasma, le poumon et le
liquide péritonéal chez les souris WT septiques 24 heures et 72 heures après la CLP (CLP H24,
CLP H72) par rapport aux souris contrôles. Chez les souris EndoTREM-1
-/-septiques, le niveau
de sTREM-1 dans les trois compartiments cellulaires a été partiellement ou totalement réduit,
ce qui indique que les cellules endothéliales semblent être une source majeure de TREM-1
(Figure 31B, E, H). Les taux de sVCAM-1 et IL-6 ont également été mesurés dans le plasma et
le poumon, on observe une diminution significative des concentrations plasmatiques en
sVCAM-1 et IL-6 chez les souris EndoTREM-1
-/-septiques par rapport aux souris WT septiques
(Figure 31C, D). En revanche, on n’observe pas de différence significative entre les taux
pulmonaires de sVCAM-1 et IL-6 chez les souris WT septiques et chez les souris EndoTREM-1
-/-septiques (Figure 31F, G).
On remarque également que la survie est très nettement améliorée chez le groupe de souris
EndoTREM-1
-/-par rapport au groupe de souris WT (Figure 31I).
Nous avons ensuite voulu savoir si la modulation de l'inflammation pouvait s'expliquer par
une réduction du nombre de cellules inflammatoires dans les poumons, la rate et le liquide
péritonéal (Figure 32). Pour cela, nous avons suivi par FACS l’infiltration des neutrophiles et
des monocytes Ly6C
highet Ly6C
Lowdans ces trois compartiments. Dans le poumon, on
remarque une accumulation de neutrophiles et de monocytes Ly6C
high24 heures après la CLP
chez les souris WT. Cette accumulation est réduite chez les souris EndoTrem-1
-/-septiques, ce
qui suggère que le blocage de Trem-1 au niveau endothélial réduit la mobilisation des
monocytes et des neutrophiles dans le poumon.
97
Figure 31 : La délétion de Trem-1 au niveau endothélial protège les souris
du choc septique
(A) Etude de la réponse à la phényléphrine (Phe) (panel du haut) et à l’acétylcholine (Ach) (panel du bas) au niveau d’anneaux aortiques et mésentériques de souris contrôles, WT septiques (CLP) et EndoTrem-1-/- septiques (EndoTrem-1-/- CLP), n=7-9 par groupe, *** P<0,005 (Two-way ANOVA). (B-H) Quantification par ELISA des taux de sTREM-1, IL-6 et sVCAM-1 dans le plasma, le poumon et le liquide péritonéal (PLF) des souris contrôles, WT septiques (CLP) et EndoTrem-1-/- septiques (EndoTrem-1-/- CLP), n=6 par groupe, *P< 0,05, **P<0,01 (t test). (I) Etude de la survie post CLP chez les souris WT et EndoTrem-1-/-,n=15, ***P=0,0006 WT vs EndoTrem-1-/- (Log Rank test).
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Il est à noter que la délétion de Trem-1 au niveau endothélial favorise l'accumulation dans le
poumon de cellules réparatrices à savoir les monocytes Ly6C
low(Figure 32A). On observe 72
heures après la CLP une forte infiltration de la rate par les neutrophiles et les monocytes chez
les souris WT, cette accumulation est significativement réduite chez les souris EndoTrem-1
-/-septiques (Figure 32B). En revanche, on constate chez les souris EndoTrem-1
-/-septiques une
infiltration importante de monocytes Ly6C
highet Ly6C
Lowdans la cavité péritonéale par rapport
aux souris WT (Figure 32C).
Ces observations suggèrent un rôle du TREM-1 endothélial dans la régulation du trafic
leucocytaire.
L’ensemble de ces données nous a permis de montrer pour la première fois que Trem-1 est
exprimé et inductible dans les cellules endothéliales. Il joue un rôle direct dans
l'inflammation et la dysfonction vasculaire. L’abolition sélective de Trem-1 au niveau
endothélial protège les animaux en modulant le recrutement et l’activation des cellules
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Figure 32 : Etude du trafic leucocytaire chez les souris WT et EndoTrem-1
-/-septiques
Quantification par cytométrie en flux du nombre de monocytes (Ly6CHigh and Ly6CLow) et de neutrophiles dans le poumon (A), la rate (B) et le liquide péritonéal (PLF) (C) 24 et 72 heures après la CLP, n=6 par groupe, *P< 0,05, **P<0,01 WT vs EndoTrem-1-/- (Two-way ANOVA).