Les défis de l’utilisation des siARN en milieu clinique

L’utilisation des siARN pour inhiber l’expression d’un gène relève plusieurs défis, dont la stabilité du siARN, la livraison spécifique au tissu cible et l'identification de la séquence de l'ARNm à cibler pour obtenir un le silençage efficace.

2.2.3.1 Stabilité des siARN

Afin d’assurer la stabilité des siARN, deux types de siARN ont été développées: des siARN chimiquement synthétisés et des siARN générés par digestion enzymatique. [242] Les siARN chimiquement synthétisés sont préparés avec une composition uniforme, en large quantité et avec un plus grand intervalle de modification chimique que les siARN générés par digestion enzymatique. Leurs désavantages majeurs sont le coût élevé de fabrication et le temps important de synthèse. [243, 244]

2.2.3.2 La séquence ciblée par les siARN

L'efficacité de silençage varie avec les segments de l'ARNm visés. Il est suggéré que la région visée doit être d'au moins 70 à 100 nucléotides en aval du site de traduction de l'ARNm et que les rapports de quantité des AU:GC soient à 50%.[245] Cependant, le choix des siARN en fonction de ces informations ne permet pas de définir et de viser la séquence du gène qui mène à un silençage optimal. C'est pour cette raison qu'une technique de formation des siARN par digestion enzymatique a été mise en point. La première étape consiste à amplifier les séquences nucléiques et puis la transcription par la T7 ARN polymérase. L'ADNase sera par la suite ajoutée pour digérer les séquences d'ADN se trouvant dans le milieu. À la fin de ces étapes, de longues chaînes double-brins d'ARN seront générées. Ensuite, les siARN seront générés en digérant, par la RNase III (source: E.coli.) ou par une autre enzyme nommée "Dicer", les fragments obtenus. C'est une méthode rapide à réaliser, à faible coût et semblable à la réaction endogène.[246] Dans

le cytoplasme des cellules des mammifères, "dicer" initie la réaction de silençage d'un gène en cassant les longues chaînes des dsRNA pour donner de courtes chaînes (21-23 nucléotides) d'ARN nommées siARN.[39]

2.2.3.3 Livraison des siARN

Un nouvel espoir pour le traitement des maladies incurables et des maladies génétiques a émergé avec la découverte des siARN. [247] Toutefois la livraison des siARN dans les cellules ciblées constitue un des obstacles majeurs à leur utilisation comme traitement clinique. Les siARN nus sont instables dans le sang et le sérum et ont une courte demi-vie in vivo. Leurs importants charge négative et poids moléculaire (~13 kDa) les empêchent de traverser la double membrane cellulaire et entraînent leur dégradation par les nucléases, avant leur internalisation dans la cellule.[248] Ces facteurs réduisent rapidement leur efficacité thérapeutique. Ainsi l'usage de vecteurs viraux, tels que les rétrovirus et les adénovirus modifiés, s'est avéré beaucoup plus efficace, mais engendre des préoccupations au niveau de la sécurité, des limitations au niveau de la production des vecteurs viraux en grandes quantités, la toxicité, l'immunogénicité et les interactions non spécifiques avec d'autres tissus.[249, 250] En effet, le problème principal de la transfection par les rétrovirus et les adénovirus modifiés est le risque de mutations insertionnelles. Ceci pourra résulter en l'activation des proto-oncogènes ou l'inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs, ce qui pourra mener à l'apparition de cancers.[251]

Afin de contourner les inconvénients associés aux méthodes virales, les chercheurs ont travaillé à l’élaboration de systèmes de livraison non-viraux. Les systèmes non-viraux présentent plusieurs avantages par rapport aux systèmes viraux comme la faible immunogénicité, la facilité de production et la possibilité d'une production à large échelle.[252] Deux types de systèmes de livraisons non-viraux sont couramment utilisés pour acheminer les acides nucléiques dans les cellules : la livraison à base de lipide et celle à base de polymère.[253-255] La première consiste à couvrir les acides nucléiques par des lipides (DOTIM/cholestérol par exemple) ayant des structures organisées en liposomes ou en micelles pour former des complexes nommées lipoplexes.[255] La deuxième se base sur la formation de complexes de polymères (cationiques par exemple) avec les acides nucléiques pour former des structures nommées polyplexes.[254] PEI (polyéthylénimine) et le chitosane furent parmi les polymères cationiques les plus utilisés grâce à leur efficacité de transfection élevée. PEI empêche la dégradation de l'ADN dans le compartiment endosomal pendant la maturation de l'endosome en lysosome.[253] Cependant, il a

été remarqué que PEI a été associé avec une cytotoxicité importante. [253] Autrefois, le chitosane présentait une faible stabilité par rapport à la plupart des vecteurs non-viraux. Cependant, les récents progrès technologiques dans la modification chimique du chitosane ont permis d'améliorer l'efficacité de transfection du chitosane sans modifier sa biocompatibilité et biodégradabilité. L'usage du chitosane constitue ainsi un système de livraison qui peut être non- immunogènes, non toxiques, produits en grande quantité, et pouvant se lier et condenser une quantité importante d'ADN ou d'ARN (siARN). [256] Le principal inconvénient de l'usage des vecteurs non-viraux est leur faible efficacité de transfection. [257, 258] La formation de complexes chitosane- siARN permet la condensation des acides nucléiques en nanoparticules afin de faciliter leur internalisation intracellulaire par endocytose. Ceci a lieu par des interactions entre la charge négative de la membrane cellulaire et la charge positive des nanoparticules chitosane-siARN. Ainsi l'emploi du chitosane comme véhicule de transport s'avère fort intéressant comme il offre une protection des siARN contre les nucléases, ce qui augmente leur temps de circulation dans le sang, diminue leur clairance rénale et augmente ainsi leur biodistribution. La livraison sécuritaire des siARN à l'intérieur de la cellule (par endocytose) va ainsi leur permettre de s'échapper des endosomes, de se libérer dans le cytosol de la cellule pour ainsi permettre la formation du complexe RISC et donc la destruction de l'ARNm ciblé.

2.2.4

Détermination de l’efficacité des siARN à l’aide de gènes de