Définition et caractérisation du système monocyte/M φφφφ

I.3.2.1. Origines des monocytes et des Mφφφφ

À l’origine, les Mφ ont été décrits par Elie Metchnikoff comme cellules effectrices majeures

de la réponse immunitaire lorsqu’il caractérisa une fonction fondamentale de ces cellules, la

phagocytose (237). Ces cellules sont conservées dans la plupart des espèces allant des invertébrés aux

vertébrés (238, 239). Longtemps, les Mφ ont été considérés comme «des éboueurs de l’organisme» :

cette notion a cependant beaucoup évolué depuis les dernières décennies pour étendre leur champ de

compétence. Ainsi, les Mφ constituent une population essentielle dans la réponse inflammatoire et la

réponse innée aux pathogènes, mais également dans le maintien et la restauration de l’homéostasie

tissulaire. Ils sont également impliqués dans la genèse de pathologies inflammatoires chroniques. Les

Mφ et les monocytes font partie du système phagocyte mononucléé qui regroupe également les

cellules dendritiques (DC) et les précurseurs de la lignée myéloïde dont ils sont issus. Les monocytes

sont des cellules circulantes dans le sang et constituent le réservoir périphérique des précurseurs

myéloïdes chargés du renouvellement des Mφ résidents au sein des tissus et des DC d’origine

myéloïde. Ils représentent 5 à 10% des leucocytes circulants chez l’homme et 4% chez la souris.

L’origine ontogénique des monocytes se situe dans la moelle osseuse. Ils sont issus de cellules souches

hématopoïétiques pluripotentes qui se différencient sous l’effet de différents facteurs de croissance en

précurseurs myéloïdes communs aux lignées granulocytaires et monocytaires ou en précurseurs

lymphoïdes (Figure 15). Le développement des monocytes est ensuite sous la dépendance d’un

facteur de croissance, le Macrophage-Colony Stimulating Factor (M-CSF). Les souris déficientes pour

le récepteur au M-CSF (appelé M-CSFR ou CSF-1R) ou pour ses ligands présentent un nombre de

monocytes circulant très faible (240–242). Les précurseurs myéloïdes vont passer par le stade de

différenciation monoblaste puis pro-monocyte avant d’atteindre celui de monocyte mature à partir

duquel, ils pourront quitter la moelle osseuse et rejoindre la circulation sanguine (Figure 15).

La sortie de la moelle osseuse s’effectue sous l’effet de facteurs de croissance et de

chimiokines. Les souris déficientes pour les récepteurs aux chimiokines CCR2, CCR5 ou CX3CR1 ont

un nombre de monocytes circulants diminué par rapport aux souris sauvages (243, 244). Les

monocytes circulent dans le sang 1 à 3 jours avant de migrer dans les différents tissus de l’organisme

et d’achever leur différenciation en Mφ résidents. Ce processus bien établi fut décrit dès 1939 par

Ebert et Florey (245).

53

Figure 15: Origine et différenciation des monocytes et des macrophages (Mφφφφ). D’après (246)

I.3.2.2. Hétérogénéité des monocytes

Les monocytes ont d’abord été considérés comme une population cellulaire homogène

caractérisée au niveau morphologique par un aspect irrégulier avec un noyau ovale ou en forme de

« rein », de nombreuses vésicules cytoplasmiques et un ratio cytoplasme/noyau élevé. Depuis, les

travaux de différentes équipes basés sur la purification des cellules sur gradient de densité ont montré

une forte hétérogénéité de cette population en termes de taille, de forme et de structure. Ils ont ainsi pu

mettre en évidence une population majoritaire de monocytes d’aspect régulier et de grande taille

présentant une forte activité de phagocytose ainsi qu’une production élevée d’anion superoxyde. Ils

ont aussi distingué une autre population moins importante de monocytes de plus petite taille avec une

faible activité péroxydase mais possédant une plus grande capacité de libération d’IL-1 (247–250). La

faible sensibilité de ces techniques de purification a limité les études plus approfondies. Il a fallu

attendre l’essor des techniques moléculaires utilisant les anticorps monoclonaux dirigés contre les

antigènes à la surface des cellules pour permettre de caractériser ces deux populations de monocytes

sur la base de leur expression différentielle de marqueurs de surface. Chez l’Homme, trois populations

de monocytes ont été définies par l’expression différentielle du CD14 (un corécepteur du LPS) et du

CD16 (FcγRIII).

54

La première sous-population de monocytes est dite « classique » car son phénotype correspond

à la description des monocytes initialement établie (Figure 16). Elle correspond à la population

majoritaire de «grands» monocytes et se caractérise par une forte expression du CD14 combinée à une

faible expression du CD16 (CD14

^haut

/CD16

^bas

). Elle représente 80 à 90% des monocytes circulants et

possède une forte expression du récepteur aux chimiokines CCR2 et une expression faible de CX3CR1

(récepteur à la fractalkine) (251, 252). Ces monocytes classiques ont une capacité de phagocytose

importante et in vitro, ils sécrètent préférentiellement de l’IL-10 plutôt que du TNFα ou de l’IL-1

(253).

Figure 16: Représentation biparamétrique des trois populations de monocytes humains par cytométrie de flux d’après (254). Les monocytes humains dérivant du sang de donneurs sains ont été doublement marqués à l’aide d’anticorps anti-CD14 et anti-CD16 afin de détecter les différentes populations de monocytes humains.

Les travaux du groupe de Ziegler-Heitbrock (1992) (253) ont permis de caractériser la

deuxième sous-population minoritaire de « petits » monocytes par l’expression du CD16. Ces

monocytes ont une capacité de production de cytokines pro-inflammatoires plus importante que les

autres monocytes après stimulation au LPS et sont donc considérés comme des monocytes

« inflammatoires » (255). Ils sont retrouvés en plus forte proportion dans le sang de patients atteints

d’inflammation aigue (256) ou de maladies infectieuses (257). À l’inverse des monocytes classiques

(CD14

⁺

/CD16

^-

), ces monocytes inflammatoires expriment fortement le récepteur CX3CR1 et

faiblement CCR2 (251). Des études montrent que cette sous-population de monocytes exprimant le

CD16 peut être subdivisée en deux populations distinctes possédant des fonctions propres (258). La

première dite « intermédiaire » regroupe les monocytes exprimant à la fois le CD14 et le CD16

(CD14

⁺

/CD16

⁺

) (Figure 16). Cette population exprime également des récepteurs aux fragments

constants (FcR) tels que le CD64 et le CD32. Ces monocytes possèdent une activité de phagocytose et

sont responsables de la sécrétion de TNFα et d’IL-1 en réponse au LPS. A l’inverse, une deuxième

population « non classique » de monocytes caractérisée par une expression du CD16 mais de très

faibles niveaux de CD14 (CD14

^bas

/CD16

^haut

) (Figure 16)n’expriment pas les récepteurs Fc, ont une

faible activité de phagocytose et ne sécrètent pas de TNFα et d’IL-1 après stimulation au LPS. A

55

l’heure actuelle la fonction de ces monocytes n’est pas élucidée, ils peuvent cependant être retrouvés

en proportion plus importante dans le sang de patients atteints de choc septique (259).

Les cellules du système phagocytes mononuclées de souris sont caractérisées par l’expression

du marqueur F4/80 qui appartient à la famille des EGF-TM7. La majorité des Mφ résidents au sein des

tissus expriment ce marqueur phénotypique (260). Les monocytes murins l’expriment également, mais

dans une moindre mesure et sont caractérisés plus précisément par l’expression de F4/80, CD11b et

CSF-1R. Il existe aussi une hétérogénéité de la population de monocytes chez la souris. Comme chez

l’homme, on peut distinguer deux sous-populations de monocytes basées sur l’expression différentielle

du CCR2, de CX3CR1, CD62L (L-selectin) et de Ly6c, un épitope du Granulocyte antigen 1 (Gr1).

La première population de monocytes murins ayant comme phénotype

CCR2

⁺

/CD62L

⁺

/CX3CR1

^bas

/Ly6c

⁺

correspond chez l’Homme à la population majoritaire de

monocytes CD14

⁺

/CD16

^-

dit « classiques ». Ces monocytes sont associés à des fonctions

inflammatoires du fait de l’expression du CCR2 et de CD62L (molécules connues pour être

impliquées dans le recrutement de cellules inflammatoires). Parallèlement, la seconde population

caractérisée par le phénotype CCR2

^-

/CD62L

^-

/CX3CR1

^haut

/Ly6c

^-

est associée aux monocytes

CD14

⁺

/CD16

⁺

humains. Ces monocytes joueraient le rôle de patrouilleur dans la circulation sanguine

et seraient rapidement mobilisés vers les tissus en cas de lésions (261).

Malgré de fortes similitudes dans les populations de monocytes humains et murins, les

résultats des études chez la souris restent souvent difficiles à extrapoler complètement chez

l’Homme, car les systèmes expérimentaux utilisés diffèrent entre les deux espèces.

I.3.2.3. Les macrophages humains dérivés des monocytes

La majorité des tissus possède des populations de Mφ résidents. Ces cellules sont les plus

grandes du système immunitaire et possèdent un appareil vacuolaire (lysosome, phagosome,

phagolysosome, endosome) plus développé comparé à leur précurseur monocyte. Ces cellules sont

bien caractérisées pour leur rôle de sentinelle du système immunitaire au niveau des premières lignes

de défense tissulaires où ils résident et où ils sont transcriptionnellement programmés pour rencontrer

les pathogènes et les toxiques environnementaux. Pour assurer ces fonctions, les propriétés principales

des Mφ sont leur capacité de phagocytose combinée à la présentation antigénique, leur mobilité et leur

capacité sécrétrice. Les Mφ sécrètent un large panel de médiateurs cellulaires comme des cytokines

principalement, mais aussi des facteurs de croissance, des EAO et des EAN ainsi que des fractions du

complément et des métabolites de l’acide arachidonique.

56

Les Mφ jouent un rôle primordial dans le maintien de l’homéostasie tissulaire en assurant

notamment la clairance des cellules sénescentes. Ils assurent également la restauration de

l’homéostasie tissulaire en participant au remodelage et à la réparation de lésions tissulaires après une

phase inflammatoire. Ces Mφ résidents au sein des tissus sont extrêmement hétérogènes

phénotypiquement. Cette grande diversité est une conséquence nécessaire des fonctions spécifiques de

maintien de l’équilibre qu’ils assurent au niveau des différents tissus et niches au cours du

développement et de la vie adulte. Les Mφ associés aux tissus adipeux sont impliqués par exemple

dans le contrôle de la sensibilité à l’insuline et de la thermogénèse adaptative (262, 263). Les

ostéoclastes quant à eux, sont les Mφ du tissu osseux qui sont des cellules multinucléées qui

participent au remodelage osseux en résorbant l’os par dégradation de la matrice minérale (264).

Enfin, les Mφ alvéolaires présents dans les poumons sont caractérisés par une très forte expression de

nombreux récepteurs de reconnaissance de motifs conservés pour permettre l’élimination de particules

et de microorganismes de ce tissu continuellement exposé aux agressions extérieures. D’une manière

générale, ces phénotypes et ces caractéristiques fonctionnelles uniques reflètent plus l’influence du

microenvironnement cellulaire auxquels ils sont exposés qu’une origine distincte.

En effet, dans un contexte inflammatoire, l’origine des Mφ résidents comme dérivant des

monocytes sanguins circulants et recrutés aux niveaux des tissus reste la théorie prépondérante.

Néanmoins, à l’heure actuelle de nombreux travaux viennent nuancer cette vision des choses. Des

études chez la souris démontrent que certaines populations de Mφ résidents adultes comme les cellules

de Langerhans et celles de la microglie ont des origines embryonnaires. Ces populations seraient

maintenues tout au long de la vie par un auto-renouvellement local (265, 266). Par ailleurs, après une

greffe de moelle osseuse, l’observation de la reconstitution des populations de Mφ tissulaires à l’aide

de cellules marquées a permis de montrer que seul 61% des Mφ alvéolaires et hépatiques sont

remplacés par des cellules marquées du donneur un an après la transplantation. Ces résultats suggèrent

un faible renouvellement de la population de Mφ tissulaires en dehors de conditions inflammatoires

(267, 268).

Dans un contexte inflammatoire de type Th2 associé à une infection parasitaire, des études ont

mis en évidence une prolifération locale de Mφ tissulaires dépendante de l’IL-4 (269).

Ainsi, dans des périodes d’homéostasie, dans des contextes infectieux particuliers ou lors de la

résolution de l’inflammation, la contribution des Mφ d’origine embryonnaire ainsi qu’un faible niveau

d’auto-renouvellement semble suffisant pour maintenir une population de Mφ résidents. Ce

phénomène semble cependant tissu-spécifique. Néanmoins, lors de phase d’inflammation, la source

majeure de Mφ tissulaires reste toujours le recrutement des monocytes circulants.

57

I.3.2.4. Facteurs de croissance et différentiation des macrophages (Mφφφφ)

Le M-CSF et le GM-CSF regroupés sous le terme de Colonny Stimulating Factor (CSF) sont

deux facteurs de croissance hématopoïétiques essentiels dans le contrôle du nombre et de la fonction

des Mφ (270, 271). Le M-CSF est produit de façon ubiquitaire par de nombreux tissus tandis que le

taux de GM-CSF circulant est faible en condition normale et peut augmenter lors de réaction

immunitaire inflammatoire (272). Ces deux CSF transduisent leur signal via des récepteurs et des

voies de signalisation distinctes. Les deux types de récepteurs sont distribués différemment sur les

populations cellulaires myéloïdes (273). Le M-CSF et le GM-CSF favorisent la différenciation, la

survie, la prolifération et l’activation des Mφ avec cependant des réponses différentes (271, 274). Les

souris déficientes en M-CSF fonctionnel (op/op) montrent des atteintes majeures de nombreuses

populations de Mφ. Cette carence impacte gravement le développement de nombreux tissus,

soulignant le rôle essentiel de ces cellules au cours du développement et pour le maintien de

l’homéostasie (275). Les souris déficientes en GM-CSF présentent entre autre comme pathologie une

protéinose alvéolaire, suggérant un rôle primordial du GM-CSF dans la maturation des Mφ alvéolaires

(276, 277).

En condition physiologique, les Mφ sont susceptibles d’être exposés à ces deux cytokines

simultanément. Les quelques études qui ont exposés in vitro la même population de monocytes à ces 2

CSF pour mimer cette situation montrent qu’ils peuvent entrer en compétition et avoir des effets

opposés conduisant à la suppression de la réponse cellulaire à l’autre facteur de croissance (278, 279).

Les monocytes du sang exposés in vitro au M-CSF sont capables de se différentier en Mφ en 5

à 6 jours. Ils constituent un bon modèle in vitro de Mφ tissulaires (274, 280). En fin de culture, ces Mφ

dérivés des monocytes et différenciés au M-CSF sont adhérents et présentent un faible niveau

d’expression membranaire du marqueur monocytaire CD14 comparés aux monocytes. Ils possèdent

une morphologie fusiforme de type fibroblastique. A l’état inactivé, ils sécrètent de très faibles

quantités de médiateurs comme des cytokines et des chimiokines inflammatoires (TNFα, IL-12, IL-8)

ou des EAO. Les monocytes traités au GM-CSF sont couramment utilisés comme modèle pour la

différenciation fonctionnelle des DC. Cependant, l’analyse in silico révèle que leur transcriptome est

plus proche de celui des Mφ que des DC inflammatoires (281, 282). Dans ce contexte, la costimulation

avec de l’IL-4 permet de favoriser la différenciation des monocytes vers un profil de DC (283). Les

Mφ différenciés in vitro en présence de GM-CSF à partir de monocytes sanguins sont également

adhérents et présentent une morphologie ronde, caractéristique dite en « œuf sur le plat ». Ils ont perdu

l’expression membranaire du marqueur monocytaire CD14 et ont une faible capacité de sécrétion de

médiateurs en absence de stimulation. L’implication distincte de ces deux facteurs de croissance dans

58

le conditionnement transcriptionnel des Mφ lors de leur activation sera discutée ultérieurement dans le

paragraphe I.3.3.

I.3.3. Propriétés fonctionnelles des monocytes/macrophages (Mφφφφ)

I.3.3.1. Les pattern recognition receptors (PRR)

A l’origine la réponse immunitaire innée était vue comme une réponse complètement

aspécifique. Cependant, la découverte de grandes familles de récepteurs à la surface des Mφ a montré

que la reconnaissance des pathogènes par les effecteurs cellulaires du système immunitaire inné était

spécifique. Cette spécificité s’appuie sur la reconnaissance de PAMPs (Pathogen Associated

Molecular Patterns) qui regroupent des structures moléculaires exclusivement exprimées par les

micro-organismes. Ces structures sont reconnues par une superfamille de récepteurs particuliers

nommés PRR pour « Pattern Recognition Receptor ». Les PRR reconnaissent également des molécules

endogènes comme des médiateurs libérés par des cellules endommagées, des lipides ou encore des

cellules mortes. Une caractéristique fondamentale du système monocyte/Mφ est leur large spectre

d’expression de ces PRR. Les différents sous-types de Mφ peuvent même être distingués en fonction

de leur profil d’expression de ces PRR. Les PRRs comptent plusieurs familles de récepteurs incluant

les TLR (Récepteurs Toll-like), les récepteurs lectines de type-C (RLC), les récepteurs scavengers

(SR). L’activation de ces récepteurs à la surface des Mφ conduit à des processus de phagocytose ou de

sécrétion de molécules effectrices qui vont soutenir et orienter la réponse immunitaire adaptative.

I.3.3.1.1. Les récepteurs Toll-Like (TLR)

Les TLR forment une famille de récepteurs découverts dans les années 1990 comprenant 10

membres chez l’Homme et 12 chez la souris. Ces TLR sont des protéines transmembranaires de type I

possédant un ectodomaine composé de motifs riches en leucine chargé de reconnaitre les PAMPs.

C’est ce domaine qui assure la spécificité des différents TLR pour des classes de PAMPs distinctes. Ils

se composent également d’un domaine transmembranaire et d’un domaine intracytoplasmique Toll

Interleukin-1 Receptor (TIR) chargé de la transduction intracellulaire du signal. Les différentes

catégories de PAMPs reconnues par les TLR incluent des protéines, des lipides, des lipoprotéines et

des acides nucléiques dérivés d’une grande diversité de micro-organismes comme les bactéries, les

virus, les parasites et les champignons. Les différents TLR ont des spécificités distinctes en termes de

59

reconnaissance des PAMPs et de réponse immunitaire. Les TLR peuvent être divisés en deux

sous-groupes en fonction de leur localisation cellulaire (Tableau 3).

Tableau 3: Les TLR et leurs ligands connus chez l’Homme (d’après (284).

Le premier groupe est composé des TLR 1, 2, 4, 5, 6 et 11 qui sont exprimés à la surface

cellulaire, au niveau de la membrane plasmique et qui reconnaissent la plupart des composants des

membranes et des parois microbiennes tels que les lipides, les lipoprotéines et les protéines. Le

deuxième est formé des TLR 3, 7, 8 et 9 dont l’expression est exclusivement localisée dans des

vésicules intracellulaires (ER, endosome, lysosome, endolysosome) où ils reconnaissent les acides

nucléiques microbiens. La localisation subcellulaire des différents TLR est importante pour

l’accessibilité à leur ligand spécifique, pour le développement d’une tolérance immunitaire vis-à-vis

des molécules du soi ainsi que pour la transduction du signal.

Le TLR4 forme un complexe avec la protéine MD2 (Myeloid Differentiation Factor) et

ensemble ils lient le LPS, un composant de la membrane externe des bactéries gram négative (285).

Un complexe multimérique se forme alors, composés de deux ensembles TLR4/MD2/LPS et initie la

transduction du signal par le recrutement de protéines adaptatrice intracellulaire. D’autres protéines

peuvent favoriser cette interaction avec le LPS. Le CD14, une protéine dépourvue de domaine

intracellulaire et ancrée à la membrane plasmique par un groupement Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol

(GPI) lie la protéine LPS Binding Protein (LBP) en présence de LPS et le présente au complexe

60

TLR4/MD2 (286). Cette association permet la transduction du signal intracellulaire conduisant à

l’activation des voies NF-κB et Interferon Regulatory Factor 3 (IRF3) (285) (Figure 17).

Figure 17: Activation des voies de signalisation MyD88 et TRIF dépendantes par la reconnaissance de PAMPs par les TLR de surface et intracellulaires. Adapté de (285).

Le TLR2 est impliqué dans la reconnaissance d’un grand nombre de PAMPs dérivés de

bactéries, de parasites et de virus, il interagit aussi avec le zymosan, un composé de la membrane des

levures (287). Le TLR2 forme généralement des hétérodimères avec le TLR1 ou le TLR6 permettant

une reconnaissance plus spécifique des ligands. L’hétérodimère TLR2/TLR1 reconnait les

lipoprotéines triacylées dérivées des bactéries gram négatives et des mycoplasmes, tandis que

l’hétérodimèreTLR2/TLR6 reconnait les lipoprotéines diacylées issues des bactéries gram positives et

des mycoplasmes (Figure 17). L’activation du TLR2 par un agoniste induit la production de cytokines

inflammatoires comme le TNFα par les Mφ et les DC mais pas d’interféron de type I (285).

Le TLR5 reconnait la flagelline, une protéine constituant les flagelles bactériens. Le TLR3

reconnait les ARNs double brins, lesTLR7/8 les ARNs simple brin provenant de virus à ARN (Figure

17).

61

Après l’engagement des TLR avec leur ligand, ces derniers induisent une réponse biologique

spécifique en fonction de la protéine adaptatrice qui est recrutée au niveau du domaine TIR. Par

exemple, le TLR4 et le TLR3 induisent la production d’interféron de type 1 et de cytokines

inflammatoires alors que les TLR2/TLR1, TLR2/TLR6 et TLR5 induisent exclusivement l’expression

de cytokines inflammatoires. La signalisation induite en aval des TLR peut être divisée en deux voies

principales selon la protéine adaptatrice impliquée : une voie de signalisation est dépendante de la

protéine adaptatrice myeloïd differentiation factor 88 (MyD88) et une autre dépendante de la protéine

TIR-domain-containing adaptater-inducing interferon-β ( TRIFF) (Figure 17).

La protéine MyD88 est utilisée par tous les TLR à l’exception du TLR3. Son recrutement au

niveau du domaine TIR en partenariat avec d’autres protéines telles que TIR adaptor protein (TIRAP),

IL-1R Associated Kinase 4, 1 et 2 (IRAK4, 1 et 2) et TNF receptor associated factor 6 (TRAF6)

Dans le document Impact des extraits organiques de particules diesel (DEPe) sur la physiologie de macrophages humains polarisés in vitro (Page 64-200)