La publication issue de cette partie est reproduite en Annexe
Vincent QB et al. L. Buruli ulcer of extreme severity maps to the beta-defensin locus on chromosome 8. To be submitted.
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Génétique mendélienne de l’UB : introduction
La constitution de la base de données concernant l’épidémiologie de l’UB au CDTUB, étudiée en première partie, a permis l'identification de la famille comportant le cas d'UB le plus sévère parmi plus de 1500 patients traités depuis 2003 dans cette zone hyperendémique (famille BU-A, Figure 21).
Les parents se déclarent cousins issus de germains. Le cas index (07) a présenté à l’âge de 5 ans une forme œdémateuse d’UB, d’emblée multifocale, touchant les quatre membres, dont la dissémination ostéoarticulaire a progressé sous traitement, nécessitant une amputation. Sa sœur (01) a présenté à l’âge de 13 ans une forme œdémateuse intéressant l’ensemble du bras droit. Ces deux patientes
étaient séronégatives pour l’infection par le VIH. La ségrégation de la maladie dans la famille, la consanguinité et la sévérité des cas sont compatibles avec la présence d’un défaut récessif dans un gène majeur de l’immunité contre M. ulcerans. Cette hypothèse est confortée par les découvertes de
formes mendéliennes d’autres mycobactérioses communes et rares, comme la tuberculose et la bcgite disséminées (162,165,185).
Nous avons donc effectué trois types d'analyses génétiques complémentaires : une analyse de liaison génétique, une recherche de variation ponctuelle et une recherche de variation structurale, qui
ont été rendues possibles par le génotypage de plus de 900 000 SNPs sur le génome des deux patientes, de trois frères et sœurs non-atteints, et des deux parents, ainsi que par le séquençage à
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Génétique mendélienne de l’UB : sujets et méthodes
Le patient index a été identifié comme le cas d’UB le plus sévère parmi plus de 1500 patients traités au CDTUB de Pobè, Bénin, depuis sa fondation en 2003. Le diagnostic a été fait cliniquement et confirmé par coloration de Ziehl-Neelsen et amplification de la séquence spécifique IS2404 par
PCR dans de multiples échantillons en provenance de multiples lésions, y compris osseuses. La sœur du patient index a également développé un UB sévère confirmé par PCR. Les parents et les 7 autres membres de la fratrie n’étaient pas atteints. Les parents étaient consanguins (cousins au second degré). La consanguinité dans cette famille suggère un mode de transmission récessif. Nous avons
exploré cette famille par cartographie d’homozygotie (homozygosity mapping), une méthode d’analyse de liaison modèle-dépendante prenant en compte la consanguinité. La cartographie d’homozygotie identifie spécifiquement les régions du génome héritées de façon homozygote et
identique par descendance par les individus atteints seulement. L’analyse de liaison a été réalisée par le logiciel MERLIN version 1.2, avec son option cluster permettant la prise en compte du déséquilibre de liaison (186,187). Un modèle récessif à pénétrance complète a été spécifié. La recherche sur la susceptibilité génétique de développer l’UB a été approuvée par le comité d’éthique du CDTUB
(IRB00006860) et par les autorités du Plan National de Lutte contre l’UB. Un consentement éclairé a été collecté chez tous les membres de la famille participant à l’étude.
Une prise de sang a été réalisée chez les deux parents, non-atteints, chez trois enfants non-
atteints et chez les deux enfants atteints (Figure 21A). L’ADN a été extrait du sang total par la méthode Nucleon BACC2 Genomic DNA Extraction (GE Healthcare), dosé par la méthode QuantIt Picogreen dsDNA (Life Technologies) et génotypé pour plus de 900,000 marqueurs génétiques, les Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) et pour plus de 900,000 marqueurs monomorphes (dédiés à
l’identification de variants structuraux) sur la puce Affymetrix Genome-Wide 6.0. Des critères stringents de contrôle qualité ont été appliqués. Plus de détails sur le rationnel des contrôles qualité seront donnés dans la partie « Génétique complexe » de la thèse. Le contrôle qualité par individu
99 inféré génétiquement et une compatibilité des valeurs d’identité par état (IBS, identity by state)
calculées par paires d’individus, avec le lien familial déclaré. Pour l’analyse de liaison, un contrôle qualité par SNP incluait un taux de génotypage intrafamilial de 100%, une fréquence intrafamiliale de l’allèle mineur non-nulle et l’absence d’erreur mendélienne. Plusieurs mesures de contrôle qualité
classiques, comme la vérification respect de l’équilibre de Hardy-Weinberg, ne peuvent être appliquées à l’échelle d’une seule famille. Nous avons donc filtré les SNPs à une échelle populationnelle dans la population Hapmap Yoruba correspondante, et sélectionné les SNPs avec un taux de génotypage de 95% ou plus, une fréquence de l’allèle mineur non nulle, et une pvalue du test
de l’équilibre de Hardy-Weinberg supérieure à 1% (188).
La cartographie d’homozygotie permet l’identification de régions contenant les variations causales, mais pas ces variations elles-mêmes. Nous avons donc cherché des variations structurales
(larges insertions et délétions, plusieurs kilobases ou plus) par analyse du nombre de copies (Copy Number Variant, CNV) et des variations ponctuelles par séquençage de l’exome des deux patientes. L’identification de CNV repose sur l’analyse quantitative de l’intensité du signal d’hybridation des sondes nucléotidiques (le logR ratio, LRR) pour inférer un nombre normal, augmenté ou diminué de
copies dans le génome du patient à la localisation de la sonde. Cette analyse CNV pangénomique a été réalisée avec le logiciel PennCNV version 2011Jun16 (189). Le séquençage de l’exome a été réalisé sur un séquenceur Illumina Genome Analyzer IIx (Illumina) après capture de l’exome par le kit
SureSelect Human All Exon v2 kit (Agilent Technologies) couvrant 38 mégabases. Il s’agissait d’une technologie dite single-end. Les séquences obtenues étaient alignées avec le génome humain de référence (GRCh37) avec l’aligneur BWA (190). Les variants ont été déterminés à partir des séquences alignées par la suite Genome Analysis Toolkit (GATK) (191), par SAMtools (192), et Picard
Tools (http://picard.sourceforge.net). Les options GATK UnifiedGenotyper et IndelGenotyperV2 ont respectivement permis de lire des variants de type substitution et insertion-délétion courte (quelques paires de base). Les variants avec une couverture de moins de 2x et une qualité Phred-
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Figure 21. Arbre généalogique et phénotype clinique de la famille BU-A
(A) Généalogie de la famille, consanguine avec deux enfants atteints sur neuf. *génotypés. P: patient index (B-C) Le cas index a subi une amputation et est maintenant appareillé
(D-E) Forme œdémateuse sévère chez la sœur et ses séquelles
A
B
C
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Figure 22. Evolution clinique du patient index – 2005-2010
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