Voie de cytotoxicité Perforine/granzyme

La voie Perforine/Granzymes est basée sur l’exocytose polarisée du contenu de granules cytotoxiques par les cellules tueuses (CTL et NK). Ces granules lytiques sont en fait des lysosomes sécrétoires spécialisés contenant différentes protéines impliquées dans la mort par apoptose de la cellule cible (Lieberman, 2003). Un des constituants essentiels de ces granules est la Perforine, qui présente une analogie de structure avec la protéine C9 du complément ayant la capacité de former des pores dans les membranes cellulaire. Les autres constituants essentiels de ces granules sont les Granzymes qui représentent une famille de sérine protéases. Ces Granzymes sont initialement synthétisés sous forme de pro-enzymes inactives qui sont par la suite activées par un clivage protéolytique induit par la Cathepsine C présente également au niveau des granules. Chez l’Homme et la souris, les deux types de Granzymes les plus abondants et les plus étudiés sont les Granzymes A et B. Le Granzyme B (GrB) présente une spécificité de substrat très similaire à celle des caspases et clive après un résidu d’acide aspartique. De plus, d’autres constituants essentiels de type protéoglycanes ont été plus récemment décrits. En particulier, la Serglycine apparaît comme une protéine majeure des granules. Il semble que le GrB se fixe de manière non covalente à la Serglycine, ce qui conduit à la formation de complexes macromoléculaires sous la forme desquels le GrB va être

Enfin, les granules contiennent aussi des protéines permettant aux CTL de se protéger de l’action cytotoxique de leurs propres granules. La Cathepsine B, qui est liée à la membrane des granules et qui se retrouve externalisée à la suite de leur exocytose, semble ainsi protéger les CTL en induisant le clivage protéolytique et l’inactivation de la Perforine (Balaji et al., 2002). Au niveau de la synapse sécrétoire, la cSMAC se caractérise par deux sous-domaines distincts : le domaine de signalisation évoqué précédemment, et un domaine sécrétoire où a lieu l’exocytose des granules (Bossi et al., 2002 ; Friedl et al., 2005). La migration des granules cytotoxiques du cytoplasme, où ils sont dispersés, vers la synapse sécrétoire dépend d’une réorientation et d’une polymérisation rapide du MTOC (MicroTubule Organizing Center) et de l’appareil de Golgi (Kupfer et al., 1985) vers la zone de contact entre le CTL et sa cellule cible, et plus précisément vers la région centrale cSMAC (Figure 26). Initialement, les granules semblent se regrouper derrière le MTOC avant de le contourner, de migrer vers la zone de contact et de s’aligner en contact étroit avec la membrane de la région sécrétoire du domaine cSMAC. L’exocytose polarisée a alors lieu au niveau de cette zone, dans une dépression formée face à la zone sécrétoire du CTL par la membrane de la cellule cible (Stinchcombe et al., 2001b). De plus, il semble qu’une faible proportion de granules soit relarguée pour induire la mort de la cellule cible (Lyubchenko et al., 2001) et que le MTOC puisse rapidement se polariser vers une autre cible (Kuhn and Poenie, 2002), rendant ce processus hautement efficace.

Après libération du contenu des granules cytotoxiques dans l’espace intercellulaire entre le CTL et la cellule cible, les Granzymes et la Perforine vont agir de manière synergique afin de permettre l’internalisation des Granzymes et le déclenchement du processus de mort cellulaire programmée. Le Granzyme B serait libéré sous forme de complexes en association avec la Serglycine et peut-être la Perforine. Le Granzyme B se lierait alors au récepteur membranaire CI-MPR (Cation-Independant Mannose 6-Phosphate Receptor) (Veugelers et al., 2006). Après endocytose des complexes, l’activité endosomolytique de la Perforine permettrait la libération du Granzyme B dans le cytoplasme de la cellule cible où ce dernier exerce son activité pro-apoptotique (Bolitho et al., 2007 ; Pipkin and Lieberman, 2007 ; Trapani and Smyth, 2002).

Une fois libéré dans le cytoplasme de la cellule cible, le Granzyme B clive de nombreux substrats et ainsi active des voies d’apoptose dépendantes ou non des caspases (Figure 27). Parmi les premiers substrats du Granzyme B identifiés, il a été montré que de nombreuses procaspases recombinantes (procaspases-3, -6, -7, -8, -10) pouvaient être clivées in vitro en sa présence (Fernandes-Alnemri et al., 1996). En revanche, la caspase majoritairement activée in vivo semble être la caspase-3 (Yang et al., 1998). Un autre substrat important du Granzyme B correspond à la protéine pro-apoptotique BID,

appartenant à la famille Bcl-2. La mitochondrie semble donc jouer un rôle clé dans l’apoptose induite par le Granzyme B (Thiery et al., 2005). Enfin, deux équipes ont récemment découvert un nouveau substrat du Granzyme B. Ils ont montré que l’apoptose induite par un CTL, s’accompagne d’un clivage de l’α-tubuline, indépendant des caspases, suggérant ainsi un rôle du Granzyme B dans le démantèlement du cytosquelette (Adrain et al., 2006; Goping et al., 2006). En résumé, le Granzyme B est capable de tuer sa cellule cible par différentes voies notamment en induisant directement la fragmentation de l’ADN et par le clivage de substrats de mort. Cependant, il semble à l’heure actuelle que le Granzyme active préférentiellement l’apoptose par la voie mitochondriale et le clivage indirect des procaspases effectrices.

Figure 27: Les différentes voies de mort initiées par le granzyme B

Après reconnaissance par le TCR des complexes pCMH à la surface de la cellule cible, les CTL engagent la voie de lyse perforine/granzyme B par l’exocytose polarisée des granules cytotoxiques. L’exocytose entraîne la libération de la perforine et de complexes macromoléculaires granzyme B-serglycine dans l’espace intercellulaire. Après leur internalisation dans la cellule cible, le granzyme B est libéré dans le cytoplasme et induit l’apoptose en clivant directement la pro-caspase-3, ou indirectement via la caspase-8. Le granzyme B peut également cliver la protéine Bid, ce qui entraîne la libération de facteurs pro-apoptotiques mitochondriaux avec l’action conjointe d’autres membres de la famille Bcl-2 tels que Bax. Leur translocation induit la libération du cytochrome c et l’activation subséquente de la caspase-9. Les facteurs Smac/DIABLO et HtrA2/OMI inhibent l’action des IAP, permettant l’activation complète de la caspase-3. Les facteurs AIF et EndoG sont transloqués dans le noyau et induisent la fragmentation de l’ADN. Le granzyme B peut enfin provoquer l’apoptose indépendamment des caspases en clivant des substrats communs aux caspases dont ICAD, induisant la libération de DFF40/CAD, lequel participe à la fragmentation de l’ADN.