Cytocentrifugation

La cytométrie en flux ne permet pas de distinguer les hémocytes hyalins des hémocytes semi-granulaires. Nous avons alors adopté une autre approche, la centri- fugation de cellules sur lame ou cytocentrifugation, afin de déterminer si la propor- tion de ces deux autres types hémocytaires était elle aussi perturbée en présence de Wolbachia. Cette technique permet d’étaler sur lame, suite à une centrifugation, des cellules en suspension dans un tampon. Les cellules ainsi étalées peuvent ensuite être colorées afin de distinguer chaque type cellulaire, ce qui permet de quantifier leur proportion respective.

La cytocentrifugation couplée à une coloration HemacolorR nous permet de dis- tinguer les trois types hémocytaires (Figure III-4). Cette distinction se base princi- palement sur la coloration des granules et des noyaux. Ainsi les granules des hémo- cytes granulaires apparaissent en violet foncé masquant les noyaux des cellules, ceux des hémocytes semi-granulaires en violet plus clair laissant apparaître un noyau 1. Les résultats concernant la cytrocentrifugation ont été obtenus au cours du stage de Romain Pigeault, étudiant en 3eannée de Licence Écologie et Biologie des Organismes, que j’ai co-encadré avec Christine Braquart-Varnier.

CHAPITRE 1. IMPACT DE LA SYMBIOSE À WOLBACHIA SUR LE SYSTÈME IMMUNITAIRE D’A. VULGARE

de couleur violet et enfin le cytoplasme des hémocytes hyalins apparaît en rose avec un noyau de couleur violet. A l’heure actuelle, la coloration des hémocytes semi-granulaires n’est pas optimale et il est parfois difficile de les distinguer des hémocytes hyalins. L’adaptation de certaines étapes du protocole, comme le tam- pon de suspension (MAS), la concentration des colorants ou le temps de coloration, seront nécessaires afin d’obtenir une méthode fiable permettant la distinction sans équivoque de ces trois types cellulaires. Les premiers résultats obtenus sont actuel- lement utilisés pour optimiser les différents paramètres que nous appliquerons pour les quantifications des proportions hémocytaires à l’aide du logiciel ImageJ, à savoir l’optimisation de la prise d’image ainsi que la procédure automatique de comptage des différents types hémocytaires.

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Conclusion et perspectives

Le travail ainsi réalisé par Juline Herbinière, Joanne Bertaux et moi-même a permis en premier lieu de caractériser les différents types hémocytaires et certaines de leurs fonctions ainsi que les organes hématopoïétiques dont ils sont issus. Le phénomène particulier de diapédèse, rarement décrit, a également été observé, per- mettant ainsi d’établir le mécanisme probable par lequel les hémocytes d’A. vulgare sont libérés dans la circulation. L’observation en FISH d’hémocytes d’animaux in- fectés a mis en évidence la présence de Wolbachia au sein des cellules du système immunitaire, c’est-à-dire hémocytes et organes hématopoïétiques, de confirmer sans ambiguïté leur viabilité et d’estimer le taux d’infection des hémocytes. Enfin, la mise en place de la cytométrie en flux a permis de quantifier une chute de la proportion d’hémocytes granulaires chez les animaux infectés par Wolbachia.

La poursuite de ce travail se déroulera selon deux orientations. La première sera de quantifier la proportion d’hémocytes granulaires chez des animaux symbiotiques

CHAPITRE 1. IMPACT DE LA SYMBIOSE À WOLBACHIA SUR LE SYSTÈME IMMUNITAIRE D’A. VULGARE

et asymbiotiques âgés de deux ans afin d’observer l’évolution des proportions de cette population au cours du vieillissement en présence ou en absence de la bactérie. Ceci nous permettra d’observer l’impact de Wolbachia sur les cellules du système im- munitaire à long terme, notamment chez des animaux de deux ans dont le THC est plus faible que celui d’animaux non infectés. Le second axe consistera à développer des marqueurs cellulaires fluorescents spécifiques des trois types d’hémocytes com- patibles avec la FISH. Ces marqueurs, couplés à des techniques telles que l’utilisation de billes de latex ou de SephadexR ou de bactéries fluorescentes, seront fondamen- taux pour quantifier des caractéristiques de chaque type hémocytaire (phagocytose, étalement, encpasulation). Ces marqueurs, associés à la détection de Wolbachia en FISH, permettront également de confirmer l’absence de la bactérie dans les hémo- cytes hyalins. Si confirmation il y a, deux hypothèses pourraient alors être envisagées pour expliquer cette situation : soit les hémocytes hyalins sont capables de recon- naître et d’éliminer la bactérie, soit la bactérie ne colonise pas les cellules souches ou les cellules en cours de différenciation donnant ce type cellulaire car ces cellules ne possèdent pas de récepteurs permettant l’entrée de la bactérie.

D’autre part, le développement de tels marqueurs cellulaires permettra aussi d’appréhender le lignage des hémocytes au niveau des organes hématopoïétiques, à savoir comment les différents types cellulaires évoluent dans un organe. Ces mar- queurs permettront aussi de mieux comprendre l’origine des aires vierges de Wol- bachia observables en FISH au niveau des organes hématopoïétiques et surtout de savoir si ces phénomènes concernent toujours le même type cellulaire. En effet, ces aires particulières pourraient correspondre à l’émergence de lignées cellulaires dé- pourvues de bactéries. Cette absence de bactérie pourrait être soit la manifestation là aussi d’une reconnaissance de la bactérie par l’hôte, soit la disparition de récep- teurs permettant à la bactérie d’entrer dans les cellules, soit une perte stochastique de la bactérie au gré des divisions.

CHAPITRE 1. IMPACT DE LA SYMBIOSE À WOLBACHIA SUR LE SYSTÈME IMMUNITAIRE D’A. VULGARE

Par ailleurs, la présence permanente de Wolbachia au niveau des organes hémato- poïétiques d’animaux symbiotiques a pour conséquence un renouvellement continu d’hémocytes abritant la bactérie. Ceci pourrait conférer deux avantages à Wolba- chia : elle permettrait à la bactérie, d’une part, de coloniser et de maintenir un taux d’infection de tous les tissus de l’organisme puisque les hémocytes peuvent s’infil- trer partout et, d’autre part, d’être localisée idéalement pour assurer son transfert horizontal. En effet, il a été montré qu’un simple contact hémolymphatique entre animaux symbiotiques et asymbiotiques suffit à transmettre la bactérie (Rigaud et

Juchault 1995). Ainsi, lors d’une nouvelle infection, la colonisation des organes hé-

matopoïétiques par Wolbachia pourrait être un élément clé dans la colonisation et le maintien de l’infection chez son nouvel hôte, procurant ainsi à la bactérie un avantage incontestable. Une étude en cours sur la dynamique d’infection, par PCR quantitative (qPCR), entre les différents compartiments d’un individu, à savoir les hémocytes, les organes hématopoïétiques, les ovaires (tissu essentiel à la transmission verticale de la bactérie) et la chaîne nerveuse devrait mettre en évidence ce phéno- mène. Cette dynamique a été réalisée par l’injection de l’hémolymphe porteuse de la souche w VulC à des individus non infectés par Wolbachia.

Enfin, lors d’un transfert horizontal, les mécanismes utilisés par la bactérie pour coloniser les tissus et donc entrer dans les cellules hôtes ne sont pas connus. D’autres bactéries intracellulaires ont la capacité d’induire une endocytose provoquée par une manipulation directe du cytosquelette via l’injection de facteurs de virulence au tra- vers d’un système de sécrétion (Salmonella, Shigella) ou par une interaction de type ligand/récepteur (Listeria, Yersinia) (Cossart et Sansonetti 2004). L’utilisation de

Wolbachia marquée (par FITC ou par un kit de type BacLightTM (Rasgon et al.

2006)) ainsi qu’un marquage du cytosquelette permettraient de visualiser la dyna- mique d’infection de la bactérie au niveau de cellules de tissus non phagocytaires et d’établir si Wolbachia utilise de tels stratagèmes pour pénétrer dans les cellules saines.

Chapitre 2

Conséquences de la symbiose à

Wolbachia sur l’immunocompétence

d’A. vulgare

Plusieurs études récentes chez les drosophiles D. melanogaster et D. simulans ainsi que chez les moustiques An. gambiae et Ae. aegypti ont montré que la présence de Wolbachia peut diminuer (Fytrou et al. 2006) ou augmenter (Bian et al. 2010 ;

Glaser et Meola 2010 ; Kambris et al. 2009, 2010 ; Moreira et al. 2009 ; Teixeira

et al. 2008) l’immunocompétence de ses hôtes.

Chez A. vulgare, il a été montré récemment au laboratoire que la présence de

Wolbachia perturbe le THC (Braquart-Varnier et al. 2008). En effet, les femelles in-

fectées par la bactérie présentent moins d’hémocytes circulants à l’âge de deux ans que les femelles asymbiotiques. Ces résultats nous ont conduit à poursuivre cette étude en prenant en compte l’effet de l’âge sur ce paramètre. L’impact de Wolbachia et de l’âge sur les compétences immunitaires d’A. vulgare a également été estimé sur un paramètre classiquement testé dans ce genre d’étude, à savoir l’activité PO. L’en- semble de ces résultats a fait l’objet d’une publication dans Naturwissenschaften, « Variations of immune parameters in terrestrial isopods : a matter of gender, aging

CHAPITRE 2. CONSÉQUENCES DE LA SYMBIOSE À WOLBACHIA SUR L’IMMUNOCOMPÉTENCE D’A. VULGARE

Figure III-5 – Variation de la densité hémocytaire (a) et de l’activité PO (b) chez les femelles symbiotiques et asymbiotiques ainsi que chez les mâles à l’age de un an et deux ans. Les données présentées sont issus d’une transformations Box-Cox. Les niveaux qui ne présentent pas la même lettre sont significativement différents. La barre d’erreur présente l’erreur standard (Sicard et al. 2010).

CHAPITRE 2. CONSÉQUENCES DE LA SYMBIOSE À WOLBACHIA SUR L’IMMUNOCOMPÉTENCE D’A. VULGARE

and Wolbachia » paru en septembre 2010. Enfin, de façon à estimer le niveau global d’immunocompétence des individus, nous avons mesuré le taux de survie d’individus infectés expérimentalement par des bactéries ou des champignons. Ces paramètres ont été mesurés sur des femelles symbiotiques et asymbiotiques, ainsi que sur des mâles, le plus souvent âgés de un et deux ans. Les résultats obtenus ont ainsi révélé l’importance des facteurs endosymbiote, sexe et âge sur l’immunocompétence d’A. vulgare.

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Impacts de la présence de Wolbachia sur les pa-

ramètres immunitaires