Les résultats obtenus au cours de l’ANR EndoSymbArt, et particulièrement lors de la quantification d’expression de gènes de l’immunité, ont permis de mettre en évi- dence à la fois une tendance générale d’expression de gènes mais également quelques gènes différentiellement exprimés en présence de Wolbachia. Bien qu’une tendance à la sur-expression soit nettement visible dans les tissus immunitaires, aucun gène n’est significativement différentiellement exprimé. Trois hypothèses non exclusives peuvent expliquer cette situation : (i) le manque de profondeur de séquençage de
CHAPITRE 3. CONSÉQUENCES DE LA SYMBIOSE À WOLBACHIA SUR L’EXPRESSION DE GÈNES DE L’IMMUNITÉ
l’ensemble des banques ne permettant pas d’identifier des gènes différentiellement représentés, (ii) le fait que les différentes banques aient été construites soit à partir d’ovaires soit à partir d’animaux entiers diluant ainsi les ARNm des gènes diffé- rentiellement exprimés propre au système immunitaire ou alors (ii) le fait que ces gènes se révèlent différentiellement exprimés en présence de Wolbachia uniquement en réponse à une infection par un agent pathogène (les banques SSH d’animaux infectés par un agent pathogène ont été réalisées uniquement avec des animaux asymbiotiques). Pour mettre en évidence des variations d’expression de ces gènes, une nouvelle approche transcriptomique va être réalisée dans le cadre d’un nouveau projet ANR : l’ANR ImmunSymbArt.
3
ANR ImmunSymbArt (2010–2013) : une nouvelle
approche focalisée sur le système immunitaire
Le projet ImmunSymbArt (immunité et symbiose chez les art hropodes, coord. D. Bouchon), qui est un prolongement du projet EndoSymbArt, est centré sur les interactions entre les symbiotes et l’immunité de leur hôte. Il repose en grande partie sur une approche transcriptomique faisant appel aux nouvelles techniques de séquençage : le RNA-Seq. Cette méthode permet à la fois d’avoir un aspect qualitatif (identification de nouveaux EST) mais aussi quantitatif (fréquence de chaque EST). Ceci devrait permettre d’enrichir le répertoire de gènes immunitaires déjà identifiés, potentiellement ceux manquant dans les voies précédemment citées, mais surtout d’avoir accès directement à leur expression quantitative.
Plus globalement, ce projet vise à comprendre les processus cellulaires et molé- culaires impliqués dans le maintien et le contrôle de la symbiose. Toutefois, ce nou- veau projet se focalise plus particulièrement sur la réponse immunitaire globale des hôtes arthropodes et inclus les relations hôte/symbiote dans un contexte infectieux faisant intervenir un agent pathogène comme troisième partenaire. Les modèles uti-
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lisés comprennent les trois précédents (A. tabida/Wolbachia, S. oryzae/SPE, A. vul- gare/Wolbachia) ainsi que deux nouveaux modèles (D. melanogaster /Wolbachia et Ae. albopictus/Wolbachia).
3.1
Réalisation de banques d’ADNc du système immunitaire
et d’animaux entiers infectés par des agents pathogènes
L’une des approches majeures prévue dans ce projet est une approche trans- criptomique à large échelle, permise par les nouvelles technologies de séquençage, telle que le RNA-Seq. Pour cette approche, j’ai réalisé 16 banques d’ADNc (Ta- bleauIII-5) : trois banques d’ADNc de tissus immunitaires (animaux asymbiotiques et symbiotiques infectés par les souches w VulC et w VulM) et leur réplicat tech- nique, de la même façon trois banques d’ADNc d’ovaires et leur réplicat technique, deux banques d’ADNc d’animaux entiers asymbiotiques et symbiotiques infectés par différentes bactéries pathogènes et deux banques d’ADNc d’animaux entiers sym- biotiques et asymbiotiques injectés avec uniquement du milieu de culture stérile.
Tableau III-5 – Ensemble des banques du projet ImmunSymbArt. F = femelles entières, TI = tissus immunitaires, Ov = ovaires, S = symbiotique, A = asymbio- tique, C = injection de différentes bactéries pathogènes, NC = injection de milieu de culture.
Nom Souche Tissus Statut de symbiose Statut d’infection Nombre de banques Réponse de l’hôte aux bactéries pathogènes CA - F A C 1 NCA - F A NC 1 CS w VulC F S C 1 NCS w VulC F S NC 1 Réponse de l’hôte au symbiote TIA - TI A - 2 TISc w VulC TI S - 2 TISm w VulM TI S - 2 OA - Ov A - 2 OSc w VulC Ov S - 2 OSm w VulM Ov S - 2
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Figure III-21 – Evolution du THC sur une période de 24h chez les femelles sym- biotiques et asymbiotiques ainsi que chez des mâles infectés avec un cocktail de Gram(+), de Gram(−) ou avec L. ivanovii.
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Chaque banque d’ADNc d’animaux entiers infectés a été construite à partir d’ARN issus de trois types d’infections indépendantes : des infections réalisées avec un cocktail de bactéries Gram(+) (Micrococcus luteus et S. lugdunensis), des infec- tions réalisées avec un cocktail de bactéries Gram (−) (E. coli et V. alginolyticus) et des infections réalisées avec L. ivanovii. Pour chacune de ces infections, les ARN ont été extraits 1h, 3h et 9h après l’injection des bactéries dans l’animal. Pour chaque temps, les ARN issus de chaque infection ont été mélangés proportionnellement au nombre d’espèces bactériennes utilisées pour l’injection. Les trois mélanges qui en résultent, correspondant aux trois temps de prélèvement, sont à leur tour mélangés pour constituer le pool d’ARN permettant la réalisation de la banque d’ADNc.
Le processus d’infection des animaux a demandé certaines mises au point quant au nombre de bactéries injectées et aux temps de prélèvement des ARN après injec- tion et ce afin d’avoir un aperçu global de la réponse immunitaire. Les concentrations de bactéries ont été déterminées à partir des résultats obtenus lors des infections pré- cédentes (cf. chapitre 2 § 2.1, page 101), soit 105 bactéries.μL−1 pour chacune des souches et 103 bactéries.μL−1 pour V. alginolyticus. Ces doses bactériennes, qui ne sont pas mortelles durant les premières heures de l’infection, nous ont permis de maintenir vivants des animaux jusqu’à 24h post-injection. Les temps de prélève- ment ont été déterminés par le suivi du THC au cours de la réponse immunitaire chez des femelles symbiotiques et asymbiotiques ainsi que chez des mâles. En ef- fet, ce critère correspondrait à différentes phases de la réponse immunitaire chez les crustacés (Söderhäll et al. 2005). Les temps de 1h, 3h, 9h et 24h post-injection correspondent aux points où nous avons observés d’importantes variations dans le THC (FigureIII-21). Le point 24h devait initialement être utilisé pour la réalisation des banques mais une mortalité des femelles asymbiotiques infectées par L. ivanovii ne nous a pas permis de l’exploiter.
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