Chapitre II. Matériels et méthodes
II.2. Modèle biologique et tests de cyto-génotoxicité
II.2.1. Culture in vitro de macrophages de souris
La culture cellulaire est un outil indispensable pour des études in vitro de toxicité. La lignée cellulaire est entretenue de façon à obtenir du matériel cellulaire reproductible et en quantité suffisante, afin de réaliser l’ensemble des tests biologiques lors d’une même expérience d’exposition aux nanoparticules d’intérêt.
La lignée cellulaire RAW 264.7 que nous utilisons pour cette étude (ATCC Cell Biology Collection LGC Promochem), est une lignée de macrophages d’origine péritonéale (MA) de souris transformée par le virus AMLV (Abelson Murine Leukemia Virus) (Figure 55).
Chapitre II : Matériels et Méthodes
Figure 55: Macrophages (RAW 264.7) observés au microscope électronique à balayage (A) et au microscope optique après coloration MGG (B)
II.2.1.1.
Culture cellulaire
Après décongélation des cellules conservées dans l’azote liquide, la lignée est cultivée dans une étuve à 37°C sous 5% de CO2 dans des boîtes de culture de 25cm² ou 75cm² contenant respectivement 8mL ou 25mL de milieu de culture. Le milieu de culture (DMEMc) est composé de 10mL de sérum de veau fœtal (FVS 10%) décomplémenté (Gibco), 1 mL de pénicilline/streptomycine (50/50 ; Sigma) dans 100mL de milieu DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ; Gibco).
Les subcultures sont réalisées de la façon suivante :
Lorsque la confluence est atteinte (deux fois par semaine), les cellules adhérentes sont décollées avec un grattoir en plastique stérile (Falcon). Les cellules en suspension sont numérées (2 à 3 millions) puis centrifugées 10min à 432g et le culot est reparti dans de nouvelles boîtes contenant 20 mL de milieu frais.Un nouvel aliquot est décongelé après 15 passages des cellules en culture, afin d’éviter une dérive phénotypique ou lorsque tout changement morphologique suspect apparaît. Les aliquots sont conservés dans l’azote liquide (-196°C) ce qui assure la conservation des cellules.
II.2.1.2.
Préparation des cellules et des nanoparticules
II.2.1.2.1.
Préparation cellulaire
Les cellules sont décollées de la boîte de culture cellulaire afin d’être comptabilisées.
Numération cellulaire : test de viabilité au bleu trypan
Le bleu trypan est un colorant qui pénètre dans les cellules présentant une perte d’intégrité membranaire (cellules mortes) alors qu’il est exclu des cellules vivantes. Ce mécanisme nécessitant de l’énergie, seules les cellules possédant une source d’ATP (adénosine-5'- triphosphate)peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera le colorant et restera incolore tandis qu’une cellule morte ne pourra le rejeter et apparaitra bleue. Au microscope optique les cellules vivantes sont donc différenciées des cellules mortes. Il est alors possible de déterminer le taux de mortalité cellulaire en utilisant une cellule de Thoma qui permet de déterminer le nombre de cellules vivantes et mortes.
Pour cela on prélève 80µl de bleu trypan auquel on ajoute 20µl de la suspension cellulaire après décollement de la boîte de culture dans un tube eppendorff. Ce qui représente une dilution au 1/5ème.
Figure 56: Schéma d’une cellule de Thoma
La cellule de Thoma (Figure 56) va permettre de dénombrer les cellules mortes et vivantes correspondant au principe de numération cellulaire afin de connaître le nombre de cellules dans un échantillon. Une fois le nombre de cellules établit, il est alors possible de déterminer la viabilité cellulaire.Pour cela le quadrillage de la cellule de Thoma va nous permettre de
Chapitre II : Matériels et Méthodes
nous repérer lors du comptage des cellules. On va ainsi compter les cellules se trouvant sur le carré central en le sillonnant par des allers-retours soit 16 carrés subdivisés en 16 petits carreaux chacun. Pour les cellules se trouvant sur les bords on en choisit au préalable deux sur lesquelles les cellules seront comptées et deux autres où elles ne le seront pas. On compte alors les cellules bleues et les cellules blanches présentes dans cette chambre de comptage.Viabilité cellulaire :
34564 47é =+9:6; = ? > 7975 > 6 ? > + 6 5+=ℎ > ∗ 100+9:6; 6 5+=ℎ >
Équation II-7
Nombre de cellules par mL : Nombre de cellules vivantes comptées x 5 x 10 x 1000 (pour une dilution au 1/5ème de la suspension cellulaire dans le bleu trypan).
Nous estimons que la viabilité de la ligne cellulaire doit être supérieure à 90% pour pouvoir réaliser les différents tests cellulaires d’activité biologique.
II.2.1.2.2.
Préparation des nanoparticules
Les particules sont préparées dans le milieu de culture des cellules (DMEMc). Nous préparons des doses de particules d’une concentration de 15, 30, 60 et 120 µg pour 106 macrophages, équivalentes à 15, 30, 60 et 120µg.mL-1 et à 4,4 ; 8,8 ; 17,6 ; 35,2 µg.cm-2. Ces doses ont été choisies d’après la littérature et notamment d’après la méthode de Bruch lors de l’évaluation biologique de différents échantillons de quartz sur laquelle nous nous sommes donc basée (Bruch et al. 2004a).Afin de réaliser ces différentes concentrations on prépare une suspension de particules dans un tube eppendorff complété par du milieu de culture complet. Les suspensions sont ensuite préparées aux concentrations désirées par dilutions successives dans du milieu de culture. Des suspensions fraîches (<1heure) sont utilisés afin d’éviter tout phénomène d’agglomération.
Pour les tests in vitro, nous avons besoin de particules témoins, un témoin positif et un témoin négatif de toxicité. Pour ces choix nous nous sommes basées sur la littérature. En effet nous avons utilisé le quartz DQ12 (SBET=11m².g-1) connu pour sa toxicité et sa réactivité de surface (B. Fubini & Bruch 2004e; Bruch 2004) comme témoin positif de toxicité. Nous avons choisi de comparer nos résultats avec les cellules seules en absence de contact particulier, sans utiliser de témoin négatif. Il est en effet difficile de choisir un témoin négatif qui sera inerte en milieu biologique pour les différents paramètres étudiés et pas forcément adapté à une comparaison avec la boehmite. Cependant plusieurs travaux ont été réalisés en
utilisant différents témoins négatif de toxicité, le CaSO4(Poser, Q. Rahman, Lohani, et al. 2004; Dopp, Yadav, et al. 2005), le corindon (Al2O3)(Bruch et al. 2004) et de TiO2(Q. Rahman, Lohani, Dopp, et al. 2002).
Lors des tests in vitro les cellules seront incubées en même temps que les nanoparticules.