Culture cellulaire 27 

Une lignée commerciale de basophiles de rats (RBL-2H3) (ATCC, Manassas, VA, États-Unis) a été utilisée pour étudier les fonctions des mastocytes [91-93]. Ces cellules sont utilisées en tant que modèle d’étude des fonctions in vitro des mastocytes puisqu’elles expriment le récepteur FcεRI et sont activées lors de la connexion spécifique récepteur-IgE-antigène. Les cellules ont été cultivées dans le milieu DMEM (Multicell, Wisent Bioproducts, St-Bruno, QC, Canada) additionné de 10% de sérum bovin inactivé (Multicell) et maintenues en incubation à 37°C/5% CO2.

Une lignée commerciale de macrophages alvéolaires de rats Sprague Dawley (NR8383) (ATCC) a été utilisée. Ces rats ne développent pas les caractéristiques de l’asthme expérimental. Pour des biens de simplification, le terme « macrophages alvéolaires » désigne cette lignée dans ce mémoire sauf précision contraire. Les cellules ont été cultivées dans le milieu F12K (Multicell) supplémenté de 15% de sérum bovin inactivé et de 0,5% de HEPES et maintenues en incubation à 37°C/5% CO2.

3.2 Stimulation allergénique in vitro

Les RBL-2H3 ont été ajoutés à une plaque de 24 puits (Starstedt, Newton, MA, États-Unis) à raison d’une concentration de 3,75 x 105 _{cellules/ml dans du DMEM 10% sérum bovin. Dans}

certains puits, un anticorps neutralisant le CD200R (LSBio, Seattle, WA, États-Unis) (10 µg/ml) a été ajouté afin de confirmer la spécificité de la voie. Les cellules ont été incubées toute la nuit à 37°C/5% CO2. Les mastocytes ont été sensibilisés avec des IgE anti-DNP (Sigma, St-Louis,

MO, États-Unis) (1 µg/ml) pour 1 heure à 37°C/5% CO2 dans du RPMI (Multicell) sans additifs.

Des macrophages alvéolaires ont été ajoutés à la culture dans un ratio 1 :1 (7,5 x 105 _cellules/ml)

dans du milieu sans sérum et la coculture a été maintenue 3 h à 37°C/5% CO2. La coculture a été

stimulée avec du DNP-ovalbumine (Biosearch Technologies, Novato, CA, États-Unis) (24 µg/ml) pour 30 min ou 18 h. Les conditions observées incluaient les mastocytes seuls et l’ajout de macrophages alvéolaires avec ou sans stimulation. La pré-incubation de l’anti- CD200R avec les mastocytes avant l’ajout de macrophages alvéolaires constituait la condition contrôle quant à la voie CD200/CD200R.

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3.3 Dosage de la β-hexosaminidase

Suite à une stimulation allergénique de 30 min, les surnageants ainsi que les lysats cellulaires (obtenus avec 400 µl de triton 0,5%) ont été recueillis. Les surnageants ont été dilués avec du milieu sans sérum à un ratio 1 :3 et les lysats 1 :19. Par la suite, dans un ratio 1 :1, 50 µl des échantillons ont été ajoutés à une plaque 96 puits avec 50 µl de substrat de la β-hexosaminidase (4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide) (Sigma), lorsque le 4-methylumbelliferone est libéré, sa fluorescence peut être mesurée. Suite à une incubation de 1 h à 37°C, l’ajout de Tris 10X termine la réaction. La plaque a été lue à 360/460 nm (excitation/émission). (Lecteur de plaques Synergy H1, Bio-Tek, Winooski, VT, États-Unis)

3.4 Dosage des médiateurs lipidiques

À partir des surnageants de culture obtenus après 30 min de stimulation allergénique les cystényl leucotriènes et prostaglandines ont été dosés. Des trousses d’essais enzymatiques ont été utilisées (Cayman Chemical, Ann Arbour, MI, États-Unis) en suivant la procédure du fabriquant.

3.5 Dosage des cytokines

Suite à une stimulation allergénique de 18 h, les surnageants ont été recueillis. Les dosages de l’IL-4 et de l’IL-13 ont été effectués par kit ELISA (IL-4; R&D system, Minneapolis, MN, États- Unis. IL-13; Life technologies, Grand Island, NY, États-Unis) en suivant la procédure du fabriquant.

3.6 Modèle d’asthme chez le rat

Le modèle d’asthme utilisé est un modèle d’asthme à l’ovalbumine sur 3 semaines. Au jour 0, un groupe de rats Brown Norway (BN) (Harlan Laboratory, Indianapolis, IN, États-Unis) provenant de notre colonie (d’environ 60 jours) ont été sensibilisés par injection intrapéritonéale d’ovalbumine (Sigma) et d’adjuvant (alum) (Invivo Gen, San Diego, CA, États-Unis). Trois semaines plus tard, les animaux ont été stimulés avec 5 ml de l’allergène aérosolisé (saline + 5% ovalbumine) pendant 5 min.Ving-quatre heures suivant la stimulation allergénique, les animaux

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ont été sacrifiés. Afin de récolter les cellules des voies aériennes, des lavages bronchoalvéolaires ont été faits (injection de 5 mL de PBS-EDTA jusqu’à concurrence de 50 ml par rat).

Les lavages recueillis ont été centrifugés et les cellules resuspendues dans le milieu RPMI. Les cellules des lavages ont été comptées. Les cellules isolées de rats naïfs ou sensibilisés ont été ajoutées aux mastocytes pour stimulation à raison de 7,5 x 105 _{cellules/ml dans un ratio 1 :1.}

Suite à une stimulation de 18h in vitro, l’IL-13 a été mesuré.

3.7 Cytométrie en flux

Environ 0,5 x 106 _{macrophages alvéolaires de la lignée commerciale (NR8383) et des lavages}

bronchoalvéolaires de rats naïfs BN ont été utilisés pour le marquage. Un seul anticorps a été utilisé, soit un anti-CD200 : PE (Biolegend, San Diego, CA, États-Unis). Afin de sélectionner seulement les macrophages alvéolaires, les doublets ont été éliminés de la sélection de cellules viables. Les macrophages alvéolaires ont été identifiés comme étant les cellules de forte taille. Un échantillon non marqué a permis de confirmer la spécificité du marquage et ainsi identifier les cellules exprimant le CD200.

3.8 Analyses Statistiques

Les données sont exprimées en moyenne ± erreur type. La variance des moyennes de chaque groupe ont été comparées par ANOVA. Les données ont été jugées significatives lorsque p ≤ 0,05 bilatéralement. Les analyses statistiques ont été effectuées avec le logiciel GraphPad Prism version 5 (GraphPad Software, CA, États-Unis).

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Les trois types importants de médiateurs (médiateurs préformés, médiateurs lipidiques rapidement synthétisés et médiateurs formés de novo) relâchés par les mastocytes ont été investigués par une série d’expériences in vitro de stimulation de mastocytes en culture. Dans un premier temps, les macrophages alvéolaires utilisés provenaient d’une ligné commerciale provenant de rats Sprague Dawley qui sont résistants au développement de l’asthme. Par la suite, nous avons établi un parallèle avec des macrophages alvéolaires provenant de rats BN qui développent l’asthme allergique.

La libération des médiateurs préformés (Figure 10), qui a un rôle majeur dans la réponse immédiate suite à l’exposition à un allergène, a d’abord été étudiée. Nous avons utilisé la β- hexosaminidase comme indicateur des médiateurs préformés. Les mastocytes, sans stimulation allergénique, ont un très faible niveau de dégranulation. L’ajout de macrophages alvéolaires n’affecte pas la dégranulation des mastocytes sans stimulation allergénique. L’antigène a significativement augmenté de 550% la dégranulation. Par contre, l’ajout de macrophages alvéolaires réduit la dégranulation causée par l’antigène de façon significative (inhibition de 27%) (Figure 10). Les macrophages alvéolaires seuls produisent très peu de β-hexosaminidase (<10% de la valeur de fluorescence mesuré des mastocytes non stimulés). L’ajout d’un anticorps neutralisant le CD200R élimine l’inhibition de la dégranulation, par les macrophages alvéolaires, suggérant que cette diminution est médiée par le CD200 sur les macrophages alvéolaires.

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Figure 10. Le CD200 des macrophages alvéolaires (MA) diminue la dégranulation des mastocytes (MC). Résultats obtenus suite à 30 min de stimulation. Chaque barre représente la

moyenne ± erreur type. Les groupes statistiquement différents (p ≤ 0,05) sont identifiés par des lettres différentes. n=5

Les leucotriènes et les prostaglandines sont des médiateurs lipidiques rapidement produits et libérés par les mastocytes suivant leur activation. Leur production a été mesurée 30 min suivant la stimulation in vitro par essais colorimétriques (Figure 11-12). De base, les mastocytes libèrent 780 ± 30 pg de CysLTC4/106 cellules (Figure 11). L’ajout de macrophages alvéolaires ne

modifie pas le relâchement spontané, alors que la stimulation antigénique cause le relâchement de 1240 ± 80 pg de CysLTC4/106 mastocytes. Une tendance à l’inhibition de la production des

leucotriènes en présence des macrophages alvéolaires est observée et cette tendance est renversée par l’ajout de l’anticorps neutralisant le CD200R. Le pourcentage d’inhibition obtenu en soustrayant le niveau de production spontanée de CysLTC4 est de 55%. Pour ce qui est des

prostaglandines (PGD2) (Figure 12), la stimulation antigénique module légèrement la production

(augmentation de 23% entre mastocytes non stimulés et stimulés). L’ajout de macrophages alvéolaires en conditions stimulées et non stimulées augmente la production de PGD2 de 20%,

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Figure 11. Le CD200 des macrophages alvéolaires (MA) tend à diminuer la production des leucotriènes par les mastocytes (MC). Les résultats ont été obtenus suite à une stimulation à

l’allergène de 30 min. Chaque barre représente la moyenne ± erreur type. Les groupes statistiquement différents (p ≤ 0,05) sont identifiés par des lettres différentes. n=3

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Figure 12. Le CD200 des macrophages alvéolaires (MA) ne module pas la production de prostaglandines par les mastocytes (MC). Les résultats ont été obtenus suite à 30 min de

stimulation. (p≤0,05). Chaque barre représente la moyenne ± erreur type. Les groupes statistiquement différents (p ≤ 0,05) sont identifiés par des lettres différentes. n = 3.

Finalement, la production de cytokines a été étudiée après 18 h. Les mastocytes libèrent, entre autre, de l’IL-4 et de l’IL-13. Le dosage de ces cytokines a été effectué par ELISA. De base, la production d’IL-4 et d’IL-13 par les mastocytes seuls est très faible (< 10 pg/106 _cellules)

(Figure 13-14). Pour les deux cytokines, l’ajout de macrophages alvéolaires à la culture de mastocytes sans stimulation antigénique n’augmente pas significativement leur production. Alors qu’en présence de l’antigène, les mastocytes activent leur production d’IL-4 et d’IL-13 (IL-4 : 50 ± 10 pg/106 _{cellules, IL-13 : 200 ± 30 pg/10}6 _{cellules). L’ajout des macrophages alvéolaires aux}

mastocytes stimulés inhibe la production de cytokines (IL-4 : 50% d’inhibition, IL-13 : 60% d’inhibition). Pour ce qui est des macrophages alvéolaires seuls, leur production d’IL-4 est de 13 ± 5 pg/106 _{cellules, ce qui équivaut à la production des mastocytes en coculture non stimulés. Le}

renversement de cette inhibition par l’utilisation d’un anticorps neutralisant le CD200R (IL-4 : p = 0,03; IL-13 : p = 0,04) suggère que les macrophages alvéolaires inhibent leur production via la voie CD200/CD200R (Figures 13-14).

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Figure 13. Le CD200 des macrophages alvéolaires (MA) inhibe la production d’IL-4 par les mastocytes (MC). Résultats obtenus suite à 18 h de stimulation. Chaque barre représente la

moyenne ± erreur type. Les groupes statistiquement différents (p ≤ 0,05) sont identifiés par des lettres différentes. n = 6.

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Figure 14. Le CD200 des macrophages alvéolaires (MA) inhibe la production d’IL-13 par les mastocytes (MC). Résultats obtenus suite à 18 h de stimulation. Chaque barre représente la moyenne ± erreur type. Les groupes statistiquement différents (p ≤ 0,05) sont identifiés par des lettres différentes. n = 6.

Étant donné que les macrophages alvéolaires provenant de rats BN naïfs sont en mesure d’augmenter l’expression du CD200 à leur surface suite à l’exposition allergénique et que ceux de rats BN sensibilisés ont perdu cette capacité (Figure 7), nous avons comparé l’effet inhibiteur des macrophages alvéolaires en interaction avec les mastocytes de ces deux groupes de rats. Les macrophages alvéolaires provenaient des lavages bronchoalvéolaires des rats naïfs et de rats sensibilisés 24 h suivant l’exposition à l’allergène en aérosol. Nous avons, par la suite, procédé à la stimulation des mastocytes in vitro tel que décrit précédemment, en utilisant les macrophages alvéolaires des lavages bronchoalvéolaires au lieu de la lignée commerciale pour les cocultures. La production d’IL-13 a été mesurée 18 h après la stimulation antigénique in vitro des mastocytes (Figure 15). Les résultats obtenus sont préliminaires, il est donc impossible de conclure définitivement à partir de ceux-ci, par contre ces résultats nous indiquent une tendance. L’antigène stimule la production d’IL-13 par les mastocytes, tel qu’observé auparavant (Figure 13). La production d’IL-13 semble diminuer de façon plus importante lorsqu’il y a interaction entre les mastocytes et les macrophages alvéolaires de rats naïfs et exposés à l’allergène comparativement à l’interaction entre mastocytes et macrophages alvéolaires de rats sensibilisés

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et exposés. Un renversement de cette tendance semble avoir lieu lorsqu’il y a ajout de l’anticorps neutralisant le CD200R. Ces résultats préliminaires suggèrent que l’augmentation du CD200 causé par l’exposition in vivo des rats pourrait avoir un pouvoir inhibiteur, mais ces résultats doivent être confirmés par des expériences supplémentaires.

Figure 15. Le CD200 des macrophages alvéolaires naïfs (MAn) tend à diminuer plus fortement la production d’IL-13 par les mastocytes (MC). Les résultats préliminaires

suggèrent que les MAn sont plus efficace pour inhiber la production d’IL-13 par les MC que les macrophages de rats sensibilisés (MAs). La diminution observée est renversée par l’utilisation d’un anti-CD200R. n = 2.

En complément à ces résultats, nous avons évalué les niveaux d’expression de CD200 à la surface des NR8383, des macrophages alvéolaires provenant de rats résistants à développer

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l’asthme expérimental, et des macrophages alvéolaires provenant de rats BN. Une différence dans l’expression du CD200 pourrait justifier l’inhibition des mastocytes par les NR8383 (Figure 14) et non par les macrophages alvéolaires de rats BN stimulés à l’antigène (Figure 15). L’expression du CD200 chez les deux lignées a été mesurée en cytométrie en flux. Les NR8383 expriment significativement plus de CD200 à leur surface que les macrophages alvéolaires provenant de rats BN naïfs et exposés à l’antigène (Figure 16).

Figure 16. L’expression du CD200 à la surface de différentes lignées de macrophages alvéolaires (MA) de rats. L’expression du CD200 à la surface des macrophages alvéolaires de

rats BN naïfs et de macrophages alvéolaires de rats SD (MA SD) par cytométrie en flux. (A) Stratégie de sélection des macrophages alvéolaires décrite à la section 3.7. Chaque point représente une cellule. (B) Confirmation de marquage (bleu) en comparaison à une population non marquée (rouge). (C) Différence d’expression entre macrophages alvéolaires de BN (bleu) et macrophages alvéolaires de SD (rouge), (D) médiane de fluorescence associée au marquage de CD200. Les macrophages alvéolaires de rats Brown Norway (BN) expriment moins de CD200 que les macrophages alvéolaires de SD. * : p = 0.005 n = 3.

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La faible expression du CD200 sur les macrophages alvéolaires de rats BN naïfs pourrait expliquer que ceux-ci n’inhibent pas la production d’IL-13 par les mastocytes aussi efficacement que les macrophages alvéolaires de rats BN sensibilisés (Figure 14). Bref, les résultats obtenus tendent à démontrer que la voie CD200/CD200R est importante pour prévenir l’activation des mastocytes. L’augmentation de l’expression du CD200 chez les animaux naïfs contribue à réduire la production d’IL-13, alors que cet effet tend à être moindre chez les animaux sensibilisés.

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Le contrôle de l’asthme demeure imparfait chez bon nombre de sujet, d’où l’importance de mettre en place de nouvelles thérapies [5 ,15]. À ce jour, les traitements existants ne sont pas en mesure de convenir à toute la gamme d’asthmatiques, il faut alors penser à de nouvelles voies à emprunter afin d’améliorer la qualité de vie de ces asthmatiques incontrôlés. Le CD200, une molécule immunosuppressive, gagne en popularité suite à ses évidences curatives dans plusieurs modèles inflammatoires [74-75]. La présente étude s’intéresse à l’asthme allergique qui est le résultat d’une cascade d’interactions entre les cellules immunes des voies respiratoires. Chez les patients asthmatiques, la présence accrue des mastocytes au niveau de l’épithélium [26] favorise les interactions avec les cellules résidentes; les macrophages alvéolaires. Les échanges entre ces cellules peuvent s’effectuer à partir de molécules de surface, comme le CD200. Ce dernier, exprimé par les MA, semble avoir un effet bénéfique dans l’asthme [88]. Par contre, son mode d’action dans la pathologie est, à ce jour, peu connu. Étant donné le rôle important des mastocytes dans l’asthme allergique, nous voulions caractériser l’effet du CD200 sur leur activation par un antigène. Pour se faire, une lignée de macrophages alvéolaires (NR8383) provenant d’une souche de rat résistant au développement de l’asthme expérimental a été utilisée pour étudier la modulation des fonctions mastocytaires par les macrophages alvéolaires.

L’effet du CD200 des macrophages alvéolaires sur la dégranulation des mastocytes n’est pas suffisant pour expliquer la suppression complète de l’hyperréactivité bronchique in vivo. Le relâchement de β-hexosaminidase, indicateur de la dégranulation, dans le milieu diminue de façon significative en présence des macrophages alvéolaires, mais n’est pas totalement inhibée. À l’opposé, le sodium chromoglycate, un médicament ciblant la stabilisation des mastocytes, inhibe complètement la dégranulation de ces cellules [94]. La réduction de la dégranulation des mastocytes n’est peut-être pas suffisante pour expliquer par elle seule les résultats obtenus in vivo démontrant l’inhibition totale de la réponse immédiate par le CD200 [88]. La combinaison de plusieurs signaux inhibiteurs pourrait être nécessaire. En parallèle, des médicaments couramment utilisés pour soulager les symptômes de l’asthme, comme les glucocorticoïdes n’affectent pas la dégranulation, et doivent être combinés avec les agonistes pour le β2- adrénorécepteur, qui eux inhibent la dégranulation des mastocytes humains [95-96]. Le traitement combinatoire permet d’empêcher l’hyperréactivité bronchique, bien que l’inhibition de la dégranulation ne soit que partielle. Donc, bien que la dégranulation soit un évènement

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important dans la cascade d’exacerbation, son inhibition partielle peut expliquer en partie l’effet inhibiteur du CD200 observé in vivo dans le modèle d’asthme chez le rongeur [88].

Le CD200 des macrophages alvéolaires diminue la production de leucotriènes par les mastocytes sans affecter la production de prostaglandines, ce qui pourrait expliquer la diminution de la réactivité bronchique observée in vivo, alors que le recrutement de cellules Th2 demeure inchangé suite à l’administration de CD200. Les leucotriènes jouent un rôle dans le recrutement des cellules inflammatoires au poumon, mais aussi dans la bronchoconstriction [97]. Ces médiateurs sont les agents spasmogènes endogènes les plus puissants, leur inhibition apporte donc une grande contribution au soulagement des symptômes de l’asthme [27]. Les prostaglandines facilitent l’accumulation des cellules Th2 et des éosinophiles dans la phase effectrice de l’asthme [98]. Ces médiateurs lipidiques rapidement formés ont été dosés suite à 30 min de stimulation. Pour les leucotriènes, une inhibition par le CD200 des macrophages alvéolaires est observée. Similiairement, une étude sur l’effet combinatoire des deux traitements conclue que les agonistes β2-adrénergiques de longue action inhibent (20% d’inhibition) la production de leucotriènes et prostaglandines par les mastocytes [96]. Nous observons une diminution de la production des leucotriènes de 20% en réponse à l’interaction CD200/CD200R. À l’inverse, une autre étude, plus récente, portant sur la combinaison glucocorticoïdes et agonistes β2-adrénergique de longue action ne démontre aucun effet sur la production de leucotriènes [95]. Leur temps d’exposition n’étant pas le même, et les concentrations non plus, cela pourrait expliquer les divergences entre les deux. Pour ce qui est des prostaglandines, leur production est augmentée par la présence des macrophages alvéolaires. Il est possible que les mastocytes et les macrophages alvéolaires interagissent via une autre voie afin de stimuler la production de PGD2. Ces résultats préliminaires suggèrent que le CD200 a un effet sur la voie de

biosynthèse des leucotriènes, mais il est impossible de conclure pour les prostaglandines. Ces résultats restent à être confirmés. Concrètement, une diminution de la production de leucotriènes empêcherait l’augmentation de la réactivité bronchique, toutefois, puisque les prostaglandines ne sont pas diminuées, le recrutement des cellules effectrices ne devrait pas être affecté.

Le CD200 des macrophages alvéolaires diminuent de façon importante la production de novo des cytokines Th2 par les mastocytes, ce qui pourrait expliquer les effets bénéfiques du CD200

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in vivo sur l’hyperréactivité bronchique et le recrutement des cellules Th2. Suite à 18 h de stimulation à l’allergène, la présence des macrophages alvéolaires inhibe de façon importante la production de cytokines pro-inflammatoires IL-4 et IL-13. Peu d’études portant sur la production d’IL-4 et d’IL-13 par les mastocytes sont retrouvées dans la littérature. Par contre, certaines études portant sur la modulation de la production de TNF par les mastocytes. Le TNF est une cytokine présente dans les granules libérées rapidement mais elle est aussi synthétisée de novo. L’inhibition de la production de TNF par les mastocytes peut se faire par le sodium cromoglycate [99], par contre, peu d’études confirment ces résultats, et ses effets sont principalement documentés au sujet de la stabilisation du mastocyte, donc de la dégranulation. De façon similaire, les traitements aux glucocorticoïdes sont reconnus pour inhiber la production de cytokines et chimiokine (TNF, CCL2, CXCL8, CCL4) suite à 24 h de stimulation par les mastocytes, et cette inhibition participe à la régulation négative de la phase tardive asthmatique [95]. La voie du CD200 semble être aussi efficace dans l’inhibition de la production de cytokines de type Th2 que les traitements déjà reconnus pour assurer ce rôle. Le CD200 se distingue par son effet inhibiteur sur les réponses immédiates et tardives des mastocytes, bien que ses effets immédiats soient moindres.

In vivo, les macrophages alvéolaires de rats BN naïfs protègent contre le développement de l’hyperréactivité bronchique et cet effet protecteur concorde avec leur capacité à augmenter l’expression du CD200 à leur surface suivant l’exposition à un allergène [58]. Nous avons donc voulu vérifier si cet effet protecteur était effectif sur l’activation des mastocytes. Pour se faire, nous avons comparé l’inhibition de la production de cytokine (IL-13) engendrée par les macrophages alvéolaires des groupes de rats sensibilisés et naïfs suivant l’exposition à l’allergène. Les macrophages alvéolaires provenant de rats naïfs et exposés à l’allergène tendent à inhiber l’activation des mastocytes plus fortement que les macrophages alvéolaires provenant d’animaux sensibilisés et exposés à l’allergène. Les macrophages alvéolaires provenant d’animaux naïfs protègent contre le développement de l’asthme expérimental [58], et ils