Les critères de jugement des colorations : [3] Les critères de sélection que nous avons choisis sont:

Matériels et méthodes

II. MATERIELS ET METHODES :

II.3 Les critères de jugement des colorations : [3] Les critères de sélection que nous avons choisis sont:

● Coloration : 3 colorations ont été définies:

 Brillance comporte 3 niveaux :

Le gris Le gris rosé Le rouge

● Netteté de l’image: la clarté de l’espace interstitiel entre les hématies

III. RESULTATS :

La variation de la netteté et la forme des globules rouges selon les deux méthodes de coloration MCDH (RAL Stainer) et May-Grunwald-Giemsa (MGG) à pH7 (Sysmex SP1000) sont représenté dans les graphes suivants :

Figure 8. Graphe représentant la variation de la netteté des frottis sanguins selon les deux

méthodes de coloration : automatique et semi-automatique.

Figure 9. Graphe représentant la forme des globules rouge selon les deux méthodes

IV. DISCUSSION :

La réalisation ou la confection d'un frottis sanguin de bonne qualité ou d'un bon frottis sanguin doit suivre une procédure précise avec un minimum d'entrainement et une maitrise parfaite de la manipulation des produits sanguins. La réalisation d'un bon frottis nécessite également la maitrise des manipulations à effectuer en adéquation avec le matériel choisi [8]. La préparation du frottis se fait à partir de sang total, prélevé récemment (moins de 6 heures idéalement) soit par ponction veineuse sur tube éthylène diamine tétra-acétique (EDTA), soit directement par prélèvement capillaire si la ponction veineuse n’est pas réalisable. La qualité du matériel utilisé est un élément essentiel : lames de verre dégraissées à bord rodés et pans coupés, tubes capillaires en verre. L’opérateur prendra soin d’utiliser des gants jetables, compte tenu du risque de contact avec le sang. La technique manuelle d’étalement suit les étapes décrites ci-dessous, et doit être réalisée par un opérateur habilité: [2]

 préparer la ou les lames, posées horizontalement sur un plan dur non incliné ;

 homogénéiser le sang dans le tube par retournements successifs (insister en cas de leucopénie) ;

 déposer une goutte de sang à l’extrémité de la lame ;

 maintenir la lame posée avec la main non directrice, et présenter avec la main directrice une seconde lame inclinée de 30◦ à 45◦ devant la goutte;  mettre en contact la seconde lame avec la goutte en la tirant en arrière, puis laisser diffuser le sang le long de l’arête (bien faire attention à récupérer la totalité de la goutte) ;

 étaler le sang vers l’autre extrémité de la lame posée en glissant la seconde lame d’un mouvement régulier, sans appuyer exagérément, de manière que la totalité du sang soit étalée sur la lame ;

 identifier le frottis selon la procédure en vigueur dans le laboratoire, puis le laisser sécher à l’air libre sans forcer le séchage (pas d’agitation ou d’utilisation de séchoir, qui peuvent abîmer les cellules et compromettre leur identification ultérieure).

Lors de l’étalement, il convient d’adapter son geste à la viscosité du sang : [2]  sang de viscosité basse (anémie) : le mouvement doit être plus rapide

que la normale et/ou la lame tenue plus verticalement (angle supérieur à 45◦) ;

 sang de viscosité haute (polyglobulie, hyperleucocytose supérieure à 100 g/l, hypergammaglobulinémie) : le mouvement doit être plus lent et/ou la lame tenue moins verticalement (angle inférieur à 45◦).

Les analyseurs modernes peuvent être équipés d’un étaleur, qui permet la préparation automatisée des frottis de sang. L’étalement est réalisé selon le même principe que la méthode manuelle avec une adaptation des paramètres d’étalement de l’automate au taux d’hématocrite afin d’obtenir une qualité de frottis reproductible quelle que soit la viscosité du sang [2].

Figure 11. Adaptation de la technique d’étalement à la viscosité du sang [2].

Le frottis sanguin n’a qu’une conservation limitée et doit être coloré rapidement, sans fixation préalable. Il peut être coloré par différentes techniques : la plus couramment utilisée est celle de May-Grünwald-Giemsa, pour réalisation de la formule leucocytaire et étude morphologique des cellules, mais peuvent également être utilisées des techniques cytochimiques (mise en évidence de la myéloperoxydase dans des blastes sanguins par exemple) ou immunocytochimiques [2].

La coloration manuelle des frottis sanguins par May-Grünwald-Giemsa est réalisée selon les étapes suivantes : (MGG)

Les frottis ou appositions doivent être séchés très rapidement (agitation à l’air, lames préchauffées à 40◦C sur platine, lampe à infrarouges, sèche-cheveux sur position « froid », hotte ventilée ...). Pour autant la dessiccation des frottis n’est pas une véritable fixation et il faut faire agir un fixateur comme le méthanol. Comme le rappelle Bessis « Lorsque les frottis sont destinés à être colorés par le MGG on utilise la fixation par le méthanol absolu » mais « en pratique la solution-mère de May-Grünwald est dissoute dans le méthanol qui sert de fixateur ». C’est pourquoi dans toute coloration de MGG le premier temps (May-Grünwald pur) est une étape de fixation et les cellules qu’on examine à l’issue de ce temps ne présentent aucune coloration. Dans la plupart des équipes, on utilise soit la méthode de Bessis (3 minutes de solution alcoolique de May-Grünwald pure versée sur les frottis/appositions afin qu’ils soient entièrement couverts), soit le méthanol absolu (un minimum de 2 minutes, le temps optimal étant de 10 à 15 minutes pour Lopez Cardozo, 10 minutes étant la durée généralement choisie par les équipes qui travaillent en récipients, que ce soit en méthode manuelle ou automatisée) .

Les deux temps de la coloration : [11]

Après le temps de fixation (3 à 5 minutes de May-Grünwald pur versé sur les frottis/appositions afin qu’ils soient entièrement couverts, ou 10 minutes de méthanol absolu en bac à coloration), on ajoute autant d’eau tamponnée qu’on aura utilisé de May-Grünwald : 2 à 3 minutes (Wright) ,3 minutes (Bessis) ou 5 minutes (Koss). Ce n’est que lorsque le May-Grünwald est dilué pour moitié avec de l’eau tamponnée qu’on obtient une coloration. Wright(1902) précise que l’application du mélange de Romanowsky (l’actuel May-Grünwald) donne aux hématies une teinte bleue, et que la coloration différentielle ne se développe

qu’avec le rinçage à l’eau en fin de coloration (de préférence distillée), les hématies devenant «verdâtres, puis jaunâtres et finalement orangées ou rosées », la décoloration prenant 1 à 3 minutes et l’eau de rinçage résultant de la décoloration étant bleue.

Après le temps de coloration au May-Grünwald dilué on doit éliminer le colorant et, sans laver, passer les lames dans la solution de Giemsa. On doit préparer la solution de Giemsa extemporanément : Bessis préconise de préparer « 30 mL d’eau distillée dans une éprouvette avec 15 gouttes de Giemsa près de la surface : le colorant reste à la partie supérieure de l’eau sans se mélanger. Puis on verse le contenu de l’éprouvette sur les lames, frottis à la face inférieure pour éviter que des précipités ne tombent sur la surface colorée ». La durée de la coloration est de 10 à 30 minutes (Bessis) ou de 15 minutes (Koss) .Les frottis sont ensuite lavés sous un fort courant d’eau du robinet (running water : 1 à 3 minutes pour Wright, 1 à 2 minutes pour Koss), ce qui permet de développer tous les aspects de la polychromie, puis séchés.

Ces précisions appellent deux commentaires : dans la dilution de la solution-mère de Giemsa, Bessis ne conseille pas d’utiliser de l’eau tamponnée mais seulement de l’eau distillée, ce que reprennent Ganter et Jolles ainsi que Koss y compris dans l’édition de 2006, page 1616 , et colorer à l’envers, c’est le principe de fonctionnement de l’automate fermé Bayer Hématek®2000. Bessis(1972) ainsi que Lopez Cardozo (1973) recommandent de ne pas monter les lames avec des lamelles (pratique répandue dans les laboratoires de biologie polyvalente et en hématologie)

En ce qui concerne le choix du tampon ou pH optimal, Bessis donne comme plage optimale un pH de 6,6 à 7 selon les concentrations respectives d’hydroxyde de soude (NaOH) et de phosphate monopotassique (KH2PO4). Lopez Cardozo donne comme pH optimal une valeur de 6,8 de même que Spriggs et Boddington. C’est la valeur qui est donc retenue dans les recommandations actualisées. Notons toutefois que le tampon PBS à pH 7 est une bonne solution dégradée [11].

Différents problèmes peuvent modifier l’affinité tinctoriale des colorants, nuire à la qualité de la coloration et gêner la lecture et l’interprétation du frottis. Le problème le plus fréquemment rencontré est celui d’une coloration anormale du frottis qui apparait trop foncé ou au contraire trop pâle. Dans le cas d’une coloration trop foncée, il convient de vérifier que le frottis n’est pas trop épais, le temps de coloration trop long ou le temps de lavage insuffisant. Mais c’est le plus souvent un pH trop alcalin des solutions colorantes ou du tampon de rinçage qui est en cause. Le frottis est alors surcoloré : les hématies ont un aspect bleu-vert, les cytoplasmes deviennent grisâtres, les granulations éosinophiles sont grises ou bleues tandis que les neutrophiles sont très foncés pouvant simuler des granulations toxiques. Inversement une coloration trop pâle peut être due à un pH trop acide, les composants basophiles n’étant alors pas bien colorés : les hématies sont rouge-orangé, les granulations éosinophiles rouge brillant alors que les noyaux apparaissent plus pales. Enfin le temps de lavage ne doit pas être excessif. L’analyse d’un frottis comportant celle des hématies, ces éléments doivent être fixés soigneusement et ne pas apparaitre réfringents. Si les hématies paraissent réfringentes, il faut penser á une fixation défectueuse par le May-Grunwald, soit que la qualité du colorant n’est pas

correcte (le méthanol entrant dans sa composition ne doit pas contenir plus de 3% d’eau) soit qu’il n’a pas été renouvelé assez fréquemment. Le fond de la lame entre les éléments cellulaires doit être clair. Si ce n’est pas le cas, il faut vérifier que l’anticoagulant utilisé pour l’hémogramme est bien l’EDTA et non l’héparine et que le rinçage des lames a été suffisant. Mais on peut aussi

observer ce phénomène en présence d’une importante

hypergammaglobulinemie, en particulier de type IgM [10].

On peut parfois observer sur les lames des dépôts gênant l’analyse cytologique, ces dépôts qui se forment en surface de la phase liquidienne par dessiccation/précipitation des sels de colorants sont particulièrement notés en MGG dans toutes les techniques (manuelles ou automatisées) qui fonctionnent avec les lames à l’horizontale, colorant au-dessus (donc au contact de l’air), même si on travaille en « chambre humide fermée ». La seule solution pour éviter les dépôts non spécifiques est de travailler intégralement en milieu liquide (lames immergées dans le méthanol ou le May-Grünwald pur au début, puis May-Grünwald dilué et enfin Giemsa) en automate ouvert, ou bien avec l’automate fermé Bayer Hématek^®2000 où le colorant est distribué à l’interface entre la lame à l’envers (étalement en dessous) et la platine. Dans ce système, comme dans l’immersion intégrale, le colorant n’est jamais en contact avec l’air et il n’y a pas de dépôts : la sédimentation ne se fait pas sur la préparation mais sur la platine qui est ensuite rincée. Les dépôts peuvent être majorés par les lames électronégatives qui fixent les colorants basiques. La filtration des colorants ne fait qu’enlever la pellicule à la surface du liquide et modifie légèrement sa concentration, et n’empêche pas le problème de se reproduire au cycle suivant. La chaleur joue également un rôle et le stockage (à l’obscurité)

des solutions-mères à +4◦C est préférable. Enfin, la qualité des lames et leur propreté sont également des facteurs importants conditionnant celles du frottis. Il a été décrit des anomalies artefactuelles des hématies (hématies cibles) liées á des lames insuffisamment nettoyées [10].

Figure 12 . A,B,C exemples de coloration de May-Grünwald-Giemsa correcte avec des

hématies beige rosé, non réfringentes, les autres éléments colorés selon leurs constituants cellulaires et une zone intercellulaire transparente et claire [10].

Figure 13. Coloration considérée comme correcte : les hématies sont rose orangé

ou «chamois» et le cytoplasme des polynucléaires est rosé (flèche noire). Les corps lympho-glandulaires sont bien visibles. MGG × 400 [11].

Figure 14. Coloration considérée comme optimale : les hématies (cercle rouge)

sont rose orangé ou « chamois », le cytoplasme des polynucléaires est quasi transparent et les granulations bien visibles (flèche noire), les granulations des mastocytes sont violet sombre

(carré jaune) et les corps lympho-glandulaires sont bien visibles (flèche bleue). MGG × 400 [11].

Figure 15. Coloration considérée comme inadéquate : les hématies sont verdâtres,

ce qui démontre l’usage d’une solution de dilution/rinçage alcaline. MGG × 400 [11].

Figure 16 . A, B colorations réalisées avec un tampon au pH trop alcalin. Le frottis est alors

Figure 17. A, B Hématies réfringentes sur un frottis mal ﬁxé par le May-Grünwald soit que la

qualité du colorant ne soit pas correcte (le méthanol entrant dans sa composition ne doit pas contenir plus de 3% d’eau) soit qu’il n’a pas été renouvelé assez fréquemment [10].

Figure 18. Exemple de coloration mal rincée (A,B) ou de coloration réalisée à partir d’un

prélèvement fait sur héparine et non sur EDTA (C,D). Le fond de la lame entre les éléments cellulaires n’est pas net. On peut aussi observer ce phénomène en présence d’une importante

Le frottis sanguin peut être coloré par la coloration de Wright qui est très répandu aux Etats Unis elle permet la réalisation de formule sanguine et médullaire. Le colorant de Wright est un mélange de Bleu de méthylène, d’Eosine et d’Azur de méthylène. Il fixe le frottis par son alcool méthylique et comme tous les colorants neutres en solution alcoolique, il ne libère son activité colorante qu’après addition d’eau tamponnée [13].

Tableau III. Produits nécessaires à la coloration [13].

Nom Références Conditionnement Coloration de Wright en

solution

320400 125, 1000, 2500 ml

Tampon pH= 7.0 361600 6 doses pour 6 × 1 L

Tampon pH = 6.8 363568 6 doses pour 6 × 1 L

Tampon pH= 7.2 363572 6 doses pour 6 × 1 L

Tampon pH= 7.0 en solution pour hématologie

330370 1000, 5000 ml

Tampon pH= 6.8 en solution pour hématologie

330068 1000, 5000 ml

Tampon pH= 7.2 330372 1000, 5000 ml

Il existe deux techniques de coloration : [13]

Technique par recouvrement : Temps de réalisation : 9 minutes

 Couvrir le frottis avec 1 mL de Colorant de Wright en solution pendant 2 minutes.  Egoutter l’excédent sur papier filtre

 Couvrir le frottis avec le Colorant de Wright dilué en solution au 1/5

dans un Tampon en solution pour Hématologie pendant 5 minutes.  Rinçage dans deux bains de Tampon en solution pour Hématologie.

Laisser en contact 1 minute dans chaque bain. Technique par bain : Temps de réalisation : 11 minutes

 Bain de Colorant de Wright en solution pendant 3 minutes.

 Bain de Colorant de Wright en solution dilué au 1/6 dans un Tampon en solution pour Hématologie pendant 6 minutes.

 Rinçage dans deux bains de Tampon en solution pour Hématologie. Laisser en contact 1 minute dans chaque bain.

Tableau IV. Résultats de la coloration [13]. Noyau / chromatine Rose- violet

Granulocytes : Granulations éosinophiles Granulations basophiles Granulations neutrophiles Rouge orangé Violet foncé Violet-rose Lymphocytes :

Cytoplasme Bleu á bleu gris

Monocytes :

Cytoplasme Bleu á bleu gris

Hématies Rougeâtre á beige (selon le choix du tampon)

Un frottis de bonne qualité est indispensable afin d’éviter toute erreur artefactuelle lors de sonexamen au microscope. Il comprend les caractéristiques suivantes : [2]

 homogène en longueur et en largeur ;  discrètement plus étroit que la lame ;

 d’épaisseur décroissante au fur et à mesure qu’on s’approche de  l’extrémité de la lame ;

 sans franges ;

 s’arrêtant à petite distance de l’extrémité de la lame.

Un frottis de mauvaise qualité peut être source d’erreurs, entraînant : [2]  une analyse morphologique des cellules (leucocytes, hématies)

difficile, voire impossible ;

 une difficulté à identifier des cellules anormales ;

 une formule leucocytaire faussée par une répartition hétérogène des différentes populations leucocytaires.

Figure 19 . Exemple d’un frottis sanguin correct : homogène,

Figure 20. Exemples de mauvais frottis [2].

A. Frottis trop court.

B. Frottis inhomogène (pression variable lors de l’étalement). C. Frottis arrondi en langue-de-chat.

D. Frottis trop long. E. Frottis mal terminé.

F. Frottis inhomogène (lame grasse).

Certains frottis sanguins d’intérêt (diagnostics d’hémopathies par exemple) doivent être conservés comme éléments de traçabilité ainsi que pour le suivi hématologique du patient. Afin de les protéger des risques d’altération (rayure, poussière, décoloration.), il est préférable de les monter sous lamelle à l’aide d’un dispositif prévu à cet effet, qui pourra être manuel ou automatisé. La conservation se fera alors pendant plusieurs années sans risque de détérioration de la qualité du frottis, selon la procédure d’archivage des lames en vigueur dans le laboratoire. L’examen microscopique se fera dans la partie moyenne du frottis, où les éléments ne sont ni trop tassés, ni trop étalés. Les hématies servent de point de repère : elles doivent être étalées en couche monocellulaire, bien

séparées les unes des autres, et leur centre clair doit être visible. Une fois la zone sélectionnée, le décompte sera effectué en parcourant le frottis selon un trajet en créneaux : c’est-à-dire en faisant défiler l’objectif verticalement jusqu’au bord du frottis puis en se décalant d’un champ une fois arrivé à l’extrémité [2].

Figure 21. Zone de décompte inadaptée : trop épaisse, hématies tassées [2].

Figure 23 . Zone optimale de décompte : hématies en couche

monocellulaire,au centre clair visible [2].

Figure 24 . Zone optimale de décompte et réalisation d’un trajet

Pour s’assurer de la qualité de la coloration, il faut d’abord vérifier la qualité du frottis. A l’œil nu, le frottis correctement coloré apparait bleu pâle légèrement teinté de rose. Des frottis colorés en bleu soutenu peuvent être observé en cas d’hypergammaglobulinemie ou de processus nécrotique. Seul le frottis est coloré, la zone intercellulaire doit rester transparente et claire. Au microscope, par des analyses morphometriques, on peut déterminer des critères quantitatifs pour juger d’une bonne coloration (rapport des colorations rouge/ vert, rouge/bleu entre 1,2 et 1,4 et vert/bleu voisin de 1) mais en pratique on se contente d’une analyse simple : les hématies doivent apparaitre beige rosé, non réfringentes et les autres éléments doivent être colorés selon leur constituants cellulaires. La zone intercellulaire doit rester transparente et claire [10].

Concernant les cellules de référence, les différents auteurs s’accordent sur le fait que ce sont les hématies et les polynucléaires qui doivent faire l’objet de l’évaluation de qualité, et pas les cellules tumorales. Les hématies doivent être d’une belle couleur « chamois » ou gris chamois, voire rosé, mais certainement pas verte ni bleue, ce qui témoignerait d’une absence de maîtrise du pH de l’eau (pH alcalin). Ce sont les cytoplasmes des polynucléaires qui doivent être regardés, car les lymphocytes sont volontiers activés, basophiles, voir «hyperbasophiles ». Les monocytes quant à eux sont souvent en voie de transformation macrophagique et peuvent être basophiles, mais pas les polynucléaires. Bessis dit à propos d’un bon MGG que «le cytoplasme des granulocytes est habituellement presque incolore» [11].

Concernant la coloration des basophiles, « les granulations basophiles (métachromatiques) sont violet foncé » et, à propos des mastocytes « les granulations, au Giemsa, ont une coloration qui varie du violet foncé au rouge

pourpre…». Les granulations azurophiles sont volontairement omises cartypiquement hématologiques. Le plus important est l’aspect des granulations neutrophiles et éosinophiles de même que la mention d’un cytoplasme de fond presque incolore pour les polynucléaires dans le cadre d’un contrôle de qualité à l’usage des pathologistes. Concernant les nucléoles (même tonalité que le noyau mais plus pâle, avec généralement une limite assez nette), ils font partie de l’interprétation du frottis pathologique mais ne peuvent faire l’objet d’une évaluation de qualité du MGG. Cette remarque peut être faite pour les lymphomes dans toutes leurs variantes : les critères d’interprétation cytopathologiques doivent s’effectuer sur des lames correctement colorées, mais on n’a pas besoin de cellules lymphomateuses pour juger la qualité d’un MGG [11].

Les techniques d'analyse morphométrique permettent maintenant aisément de mesurer les tailles, les formes et les couleurs des éléments cellulaires soumis à l'observation microscopique. L'application de la morphométrie dans le domaine de l'hématologie nécessite de ce fait une standardisation de l'observation microscopique à différents niveaux : la zone d'observation du

Dans le document Coloration panoptique en hématologie : Etude comparative (Sysmex SP 1000 et RAL STAINER (Page 53-120)