Crible des HDM en RNAi

sible au dosage de diverses HDM de la famille JmjC, du moins pour Jarid1b, Phf8 et possiblement Fih (validation en cours, 1shRNA/3 confi rmé). Devant l’importance de la méthylation des histones dans la confi guration de la chromatine et l’identité cellulaire, et de par la nature réversible de cette modifi cation, une contribution des HDM dans ce pro- cessus semble probable, et demeure une voie à explorer. Les données semblent s’arrimer avec des études récentes impliquant les HDM de la famille JmjC dans divers processus biologiques (section 1.3 de l’introduction).

5.3.1 Données du crible en regard de la littérature actuelle

Tel que discuté dans l’introduction (section 1.3), certaines HDM semblent impliquées dans l’hématopoïèse normale et leucémique, comme FBXL10 (JHDM1B, KDM2B) [182] et UTX (KDM6A) [189, 192]. Il faut bien mettre en perspective que le phénotype induit par des modulations des niveaux de transcrits de ces enzymes dépendra de la magnitude de la variation, et du contexte cellulaire. Concernant Fbxl10, une surexpression de ce gène dans le compartiment hématopoïétique semble conférer un avantage prolifératif et une moindre propension à la sénescence, sans nécessairement mener à une augmenta- tion de l’AR des CSH en termes fonctionnels. Dans le crible par RNAi présenté dans cette thèse pour les HDM, au chapitre 4, cinq constructions distinctes ciblant Jhdm1b (Fbxl10) (Figure 4.2B) n’affecte pas la reconstitution sanguine des receveurs en-deçà du seuil inférieur de la normale, 16 semaines post-transplantation. Cette différence pourrait s’expliquer par des niveaux de diminution de transcrits n’ayant pas de répercussion sur l’activité des CSH. Alternativement, un phénotype pourrait devenir apparent à plus long- terme, plusieurs mois suivant la transplantation. Il faut aussi noter que l’expression forcé d’un gène à un niveau supra-physiologique peut modifi er le destin cellulaire, sans néces- sairement conduire à un contre-phénotype lors d’une diminution du niveau de transcrits. La surexpression de Hoxb4 pourrait servir d’exemple en ce sens. En ce qui concerne la modulation du potentiel prolifératif des cellules leucémiques par FBXL10, il pourrait s’agir d’une dépendance spécifi que à ce contexte.

Concernant UTX (H3K27me3/2 HDM), bien que les résultats d’une étude suggèrent qu’il soit un régulateur positif du potentiel prolifératif des cellules hématopoïétiques normales [189], son rôle en tant que suppresseur de tumeur émerge en parallèle [192]. Encore une fois, l’impact mesuré dépendra des niveaux de transcrits, et du contexte cellulaire spécifi - que. De façon intéressante, bien qu’Utx ne soit pas une cible de notre crible primaire, (Fi- gure 4.2B), un sous-groupe de souris sacrifi ées à très long-terme (1an) démontraient une augmentation de la reconstitution sanguine pas les cellules transduites avec un shRNA contre Utx. L’échantillon étant trop petit pour conclure, cette observation méritera une expérience de validation, afi n étudier le potentiel de transformation à long-terme d’une diminution des niveaux d’Utx dans le système hématopoïétique.

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5.3.2 JARID1B (KDM5B) et activité des CSH

Les efforts de validation du crible des HDM se sont concentrés sur Jarid1b (codant pour une H3K4me3/2 HDM), et l’augmentation de l’activité des CSH induite par des shRNA contre ce gène. Une diminution de Jarid1b s’accompagne d’un bloc de différentiation, et d’une augmentation de l’activité transcriptionnelle du cluster des gènes Hoxa en 5’. Les travaux futurs concernant ce gène devront comprendre l’identifi cation des cibles directes de JARID1B, et les modifi cations épigénétiques correspondantes. La caractérisation des partenaires d’interaction de JARID1B, la nature du (ou des) complexe au sein duquel il agit sont également des questions d’intérêt. Notamment, il sera pertinent de déterminer si JARID1B oppose l’action d’un complexe méthyl-transférase, et si oui duquel. Un mo- dèle de souris knockout conditionnel permettra aussi d’évaluer l’impact ponctuel d’une délétion complète de Jarid1b dans le système hématopoïétique, tel que discuté au chapi- tre 4. Toute la sphère des cibles potentiellement non-histone devra également être adres- sée. Il est à noter qu’un inhibiteur chimique de JARID1B a été récemment décrit [205], ce qui ouvre une autre voie expérimentale intéressante. Le potentiel de cette molécule à promouvoir l’expansion des CSH in vitro devra être évalué. Ce domaine de recherche est très actif de par son application thérapeutique potentielle, tel que récemment rapporté pour la molécule SR-1 (Self-Renewal 1), un inhibiteur du récepteur aryl-hydrocarbone pouvant soutenir l’expansion des CSH humaines en culture [206]. Encore plus intriguant sera de comprendre les différences fonctionnelles entre JARID1B et JARID1A, ces deux facteur arborant un haut niveau d’homologie, et se distinguant essentiellement à leur por-

tion C-terminale, comprenant le 3ème _{domaine PHD (voir Fig1.15 de l’introduction).}

5.3.3 PHF8 et reconstitution hématopoïétique

Contrairement à JARID1B, les résultats du crible des HDM suggèrent que PHF8 (H3K- 9me2/1, H4K20me1 HDM) est un régulateur positif de l’activité des CSH. Avec trois constructions distinctes, des populations cellulaires enrichies en CSH transduites avec des shRNA ciblant Phf8 sont moins compétitives que les cellules contrôles dans des essais fonctionnels de transplantation. La caractérisation de ce phénotype devra être poursuivie, mais il est toutefois plus complexe de déterminer si un phénotype de perte-de-fonction est spécifi que à la cellule souche. Il pourrait, par exemple, être secondaire à un défait global de prolifération des cellules hématopoïétiques. Cette HDM est encore peu étudiée, mais les données disponibles semblent suggérer que PHF8 soit un régulateur positif de la prolifération [207], et du cycle cellulaire, notamment de la progression de la phase G1/S [208]. Une interaction entre PHF8 et WDR5 du complexe méthyl-transférase MLL est décrite [209], ainsi que la capacité de PHF8 de lier la marque activatrice H3K4me3 par le biais de son domaine PHD. PFH8 est aussi rapporté comme un régulateur positif de la

transcription [210], régulant particulièrement l’expression de MSX1/MSXB, un facteur de transcription à homéodomaine [211]. Globalement, ces données pourraient s’arrimer avec le phénotype hématopoïétique et fournir des pistes d’exploration pour les études ultérieures concernant PHF8.

5.3.4 FIH; autre candidat potentiel du crible

Le crible présenté au chapitre 4 a permis d’identifi er un second régulateur négatif de l’ac- tivité des CSH, soit l’inhibiteur de Hif1α (HIF1an), aussi nommé FIH (Factor Inhibiting Hif1α), dont la caractérisation fera partie d’études ultérieures. FIH est une enzyme JmjC dont l’activité catalytique modifi e post-translationnellement le facteur de transcription HIF1α (Hypoxia-Inducible Factor 1α), de façon intéressante une cible non-histone. En présence de faibles tensions d’oxygène, le senseur métabolique HIF1α est actif, formant un hétérodimère avec HIF1β lui permettant de lier ses gènes cibles, et d’induire sub- séquemment leur transcription en interagissant aussi avec le co-activateur p300 [212]. Suite à une augmentation des concentrations en oxygène, HIF1α est soumis à l’activité d’hydroxylases, incluant HIF1an/FIH qui modifi e un résidu asparagine essentiel à l’inte- raction entre HIF1α et p300. L’hydroxylation d’un résidu proline de HIF1α est médiée par une autre famille d’enzymes à domaine PHD, menant à la dégradation de la protéine par la voie du suppresseur de tumeur pVHL (Von Hippel–Lindau). Il existe donc une corréla- tion inverse entre les niveaux de HIF1α et de son inhibiteur, FIH. En théorie, une déstabi- lisation des transcrits de Fih par une approche en RNAi pourrait lever une force antago- niste exercée sur HIF1α, et freiner sa dégradation. Cet effet pourrait être particulièrement bénéfi que pour des CSH en culture, un contexte de stress oxydatif élevé, qui favoriserait normalement la dégradation de HIF1α. L’infl uence positive de HIF1α sur l’activité des cellules souches normales et leucémiques est d’ailleurs rapporté [213]. De plus, les mu- tations de IDH1/2 décrites dans les leucémies aigues, tel que discuté dans l’introduction (section 1.3), résultent en une perturbation du métabolisme de l’-kétoglutarate, générant

un néo-métabolite (D-2-hydroxyglutarate) qui stabiliserait HIF1α, contribuant possible-