Chapitre 3 : Fonctionnalisation des nanoparticules par Chimie des
III. Comparaison du couplage par chimie des carbodiimides et chimie click
III. 3. Couplages de chaines PEG
III. 3.Couplages de chaines PEG
Nous avons dans un deuxième temps comparé l’efficacité de couplage de molécules de type PEG par chimie des carbodiimides ou click. Tout d’abord, le choix des chaînes PEG à coupler a été discuté notamment en fonction de la méthode de quantification. Dans le chapitre 2, le couplage par chimie des carbodiimides du H2N-PEG4-COOH sur la nanoplateforme γFe2O3@CA a été caractérisé par deux méthodes : la méthode spectroscopique et la méthode OPA. Dans le cas des bisphosphonates la présence des bandes caractéristiques des vibrations des liaisons phosphates P-O et P=O (entre 900 et 1200 cm-1) ne permet pas d’utiliser cette méthode. En effet, la nanoplateforme absorbe au même endroit que la bande à 1106 cm-1 du PEG, correspondant à la vibration de valence ᴠC-O des éthers aliphatiques, utilisée pour la quantification, Figure 14. Ainsi pour le couplage par chimie des carbodiimides, la quantification du nombre de H2N-PEG4-COOH sur la nanoplateforme γFe2O3 @HMBP-COOH a été réalisée à l’aide du réactif OPA.
Figure 14 : Comparaison des spectres infrarouges du H2N-PEG-COOH (spectre noir) et de la nanoplateforme γFe2O3@HMBP-COOH (spectre violet)
Pour la chimie click, différentes méthodes de couplage sont possibles : la réaction de cycloaddition de Huisgen, nécessitant un groupement terminal azide sur le PEG, ou la réaction thiol-yne, nécessitant un groupement terminal thiol. Ainsi pour la comparaison du couplage de chaines PEG, deux PEG ne différant que par leur fonction terminale peuvent être
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utilisées: le N3-PEG4-COOH ou le HS-PEG4-COOH. Cependant, pour PEGyler la
nanoplateforme au maximum et pour des raisons pratiques au niveau de la quantification, la réaction thiol-yne a été préférée. En effet, celle-ci permet de faire réagir deux molécules présentant une fonction thiol sur une fonction alcyne contrairement à la réaction de cycloaddition où chaque fonction azide réagit avec une fonction alcyne. Ainsi, un meilleur taux de greffage est attendu pour le HS-PEG4-COOH. En termes de caractérisation, la méthode OPA ne peut pas être utilisée puisqu’aucune fonction amine n’est présente.
Cependant, le HS-PEG4-COOH possède un avantage majeur : la présence de l’atome Soufre.
En effet, le pourcentage atomique Fer/Soufre, qui peut être déduit de l’analyse EDX, Annexe 2, permettra la quantification.
Ainsi les deux PEG hétérobifonctionnels choisis pour cette étude sont présentés Figure 15. Ils présentent une fonction amine ou thiol nécessaire au couplage sur les nanoplateformes respectivement par chimie des carbodiimides et par chimie click et une fonction acide carboxylique, qui se retrouvera donc à la surface externe de la nanoplateforme et pourra servir au couplage d’autres molécules.
Figure 15 : Structure chimique des PEG utilisés (A) et représentation schématique de la nanoplateforme PEGylée (B)
L’efficacité du greffage, pour différents ratios R et pour différents temps de réaction dans le cas de la réaction thiol-yne, a été évaluée de manière différente selon la nanoplateforme étudiée : par dosage des fonctions amines ou par EDX. Les résultats sont récapitulés dans le Tableau 6.
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Tableau 6 : Détermination du nombre de PEG par la méthode OPA sur la nanoplateforme γFe2O3@HMBP-COOH ou par EDX sur la nanoplateforme γFe2O3@HMBP-C≡CH, tailles hydrodynamiques et potentiel de surface en fonction du ratio R et/ou du temps de réaction
Ainsi, pour un couplage par chimie des carbodiimides, les résultats montrent que le nombre de molécules greffées à la surface augmente avec le ratio R. Nous passons d’une nanoplateforme PEGylée à 9 % pour R=2 à un taux de greffage de l’ordre de 16 % pour R=50.
En ce qui concerne la chimie click, les résultats montrent que la réaction thiol-yne est une réaction plutôt rapide (taux de greffage de 51% après 30 min) et que le temps optimal de réaction se situe à 1h30 (taux de greffage de 55%). L’augmentation de la durée d’irradiation n’a pas pour effet d’augmenter le nombre de molécules par nanoparticule. En effet, après 16 h de réaction, le taux de greffage est inférieur (environ 36 %) à ceux observés à des temps plus courts. L’augmentation du ratio n’améliore pas le taux de greffage. Ainsi pour un ratio R=50 après 1h30 de réaction, on obtient une nanoplateforme PEGylée à 48 %, résultat du même ordre de grandeur que celui observé pour le ratio R=5.
D’après ces résultats, nous constatons que, pour un rapport R=5 par chimie des carbodiimides, 9 % de la nanoplateforme est PEGylée alors que ce résultat est 6 fois supérieur par chimie click (55%). Par ailleurs, même en augmentant le ratio R lors du couplage par chimie des
carbodiimides, nous obtenons seulement 16% de H2N-PEG4-COOH par nanoparticule, pour
un ratio R=50, ce qui est largement inférieur aux résultats obtenus par click. Ces différences peuvent être expliquées d’une part, par la réaction thiol-yne elle-même puisque deux molécules peuvent réagir sur une seule fonction alcyne et d’autre part, à une faible activation des acides carboxyliques à la surface des nanoparticules lors de la réaction par chimie des carbodiimides. R Temps (h) Nbre PEG /nano % Dh (nm) PdI Zeta (mV) C a rb o d ii m id e 2 - 50 ± 2 9 ± 1 16 0.3 -35 ± 6 5 - 50 ± 9 9 ± 2 16 0.3 -38 ± 6 20 - 63 ± 3 11 ± 1 18 0.3 -34 ± 7 50 - 87 ± 13 16 ± 2 18 0.3 -38 ± 10 C lick 5 0.5 204 ± 20 51 ± 5 22 0.2 -44 ± 8 5 1.5 221 ± 22 55 ± 5 19 0.2 -40 ± 7 5 16 144 ± 15 36 ± 4 22 0.2 -41 ± 6 50 1.5 192 ± 20 48 ± 5 20 0.3 -43 ± 8
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En comparaison avec le couplage des fluorophores, on remarque que le taux de greffage est supérieur pour le PEG. En effet, pour un ratio R=20, on obtenait environ 7% de R123 par nanoparticule et 38 % pour R-N3. Les taux de greffage plus importants lors du couplage du PEG peuvent s’expliquer par le plus faible encombrement stérique de celui-ci, allié à une meilleure réactivité de la fonction amine aliphatique (en comparaison avec l’amine aromatique dans le cas du R123) pour la chimie des carbodiimides ou à l’utilisation de la réaction thiol-yne pour la chimie click.
Les propriétés hydrodynamiques et le comportement magnétique des nanoplateformes PEGylées ont été étudiés et sont reportés Tableau 6 et Figure 16. Les tailles hydrodynamiques, les charges de surface et les intensités des signatures MIAplex restent stables quel que soit le taux de couplage.
Figure 16 : Evolution de la signature MIAplex® (normalisées / mg γ-Fe2O3)en fonction du rapport R (A) (R=0 en noir, R=5 en rouge et R=50 en bleu) sur γFe2O3@HMBP-COOH et (B) du temps de couplage
(R=0 en noir, R=5 30 min en rouge, R=5 1h30 en bleu sur γFe2O3@HMBP-C≡CH
En conclusion, les résultats obtenus pour le couplage de chaines PEG, montrent que la réaction thiol-yne est plus avantageuse. Elle permet d’obtenir des taux de greffage élevés, pour un temps de réaction court, et des ratios R relativement faibles.