CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
3.3. Techniques de spectrométrie de masse pour l’identification des protéines séparées par électrophorèse sur gel
3.3.2. Spectrométrie de masse à ionisation électrospray et couplages associés
3.3.2.3. Le couplage NanoHPLC ESI-MS/MS
Le couplage de la séparation chromatographique et de la détection ESI-MS a été effectué dans le but de
séparer des mélanges peptidiques de plus en plus complexes et d’obtenir un maximum d’informations de
séquences en acides aminés (216). Les développements en chromatographie avec la miniaturisation des
colonnes et en spectrométrie de masse avec la miniaturisation de la source électrospray ont permis le
couplage nanoLC-MS/MS qui est aujourd’hui un des instruments de base de l’analyse protéomique par
spectrométrie de masse (217).
3.3.2.3.1. NanoHPLC des peptides et adaptation des systèmes chromatographiques.
La nanochromatographie liquide à haute performance (nanoHPLC) de phase inverse (RP : Reversed
phase) est issue de l’expérience acquise avec les techniques micro/cap HPLC classiques. La phase mobile
du système chromatographique devant être compatible avec le phénomène d’ionisation électrospray, les
peptides sont élués par un gradient eau/acétonitrile par ordre croissant d’hydrophobicité. Une étape de
préconcentration en ligne peut être rajoutée comme l’ont préconisée Giusti et al pour l’analyse de
composés minoritaires (218). Le principe consiste à injecter un volume 100 à 1000 fois supérieur à celui
considéré optimal en nanoHPLC, avec un débit de plusieurs µL.min
-1en direction d’une cartouche de
préconcentration de diamètre capillaire (300 µm) remplie de la même phase que la nanocolonne (Figure
19). Cette étape permet de préconcentrer et de purifier l’échantillon des sels et matrice non retenus sur la
cartouche. Cette purification en ligne est un atout majeur pour une détection en ESI-MS des analytes (219)
dont l’ionisation peut être supprimée par les sels et la matrice de l’échantillon.
3.3.2.3.2. Miniaturisation de la source électrospray : la source nanospray
La miniaturisation des sources électrospray (ES) conventionnelles a permis de réduire le débit
d’échantillon délivré au niveau de la source. En 1994, Emmet et Caprioli ont développé un dispositif
micro-électrospray permettant de travailler à des débits inférieurs à 1 μL/min (220), puis Wilm et Mann en
1996 introduisent la source nano-électrospray ou nanoES délivrant un débit de quelques centaines de
nL/min. (221). La source nanoES permet d’accroître la sensibilité de la mesure grâce à une taille de
gouttelettes plus petite (environ 200 nm de diamètre) avec un rendement d’ionisation/désorption des
analytes favorisé (222). Une plus grande tolérance aux contaminations par les sels de solutions
tamponnées est également observée, et contrairement à l’ESI, la nanoESI ne requiert plus d’assistance
pneumatique contribuant à la désolvatation de l’analyte. Les diverses applications du nanospray,
notamment pour l’analyse protéomique montrent aujourd’hui l’importance d’un tel dispositif.
Des expériences de fragmentation en ligne des peptides élués (spectrométrie de masse en tandem
communément abrégée LC-ESI-MS/MS) vont alors fournir des informations de séquence permettant
d’augmenter considérablement la spécificité et la qualité des identifications. Lors d’analyses
nanoLC-ESI-MS/MS, la sélection des ions parents pour la fragmentation peut se faire automatiquement, après que
l’utilisateur ait défini la valeur seuil à partir de laquelle il y a fragmentation, ou manuellement en rentrant
la masse des ions devant être fragmentés. La valeur seuil doit être finement optimisée. Lorsque ce seuil est
placé trop bas, les ions parents sont sélectionnés dès qu’ils dépassent le seuil ce qui ne correspond pas
forcément à leur maximum d’intensité. Ce n’est donc pas à ce moment que leur fragmentation sera la plus
informative. En revanche, lorsque le seuil de sélection est placé trop haut, le risque de perdre des
informations sur des ions minoritaires est important. Pour cela une seconde analyse identique à la
première doit être réalisée, mais en fixant dans la méthode la masse des ions, détectés dans la première
acquisition en mode MS, que l’on souhaite fragmenter dans la seconde en mode MS/MS. On préfèrera
également sélectionner les ions doublement et triplement chargés qui fragmentent mieux que les ions
monochargés (223).
La nanoLC ne peut pas être utilisée seule, sans autre technique de séparation en amont, si l’échantillon est
trop complexe. En effet, un extrait protéique contient plusieurs milliers de protéines d’où des centaines de
milliers de peptides tryptiques qui ne pourront pas être séparés efficacement sur nano-colonnes. Cette
technique sera donc couplée en amont à une autre technique séparative, généralement le gel 2D. D’autres
alternatives peuvent être envisagées, comme la chromatographie multidimensionnelle ou le couplage gel
SDS/nano-LC, méthodes développées afin de s’affranchir des limites liées aux gels 2D. Même si elle
correspond à un gain de résolution significatif, la nanoLC-ESI-MS/MS se trouve limitée par le nombre de
pics effectivement séparés sur la nano-colonne de phase inverse. Cette limite a conduit au développement
de différentes approches utilisant des chromatographies bi- ou multi-dimensionnelles.
Du fait de la bonne sensibilité de détection jusqu’à quelques femtomoles de matériel du couplage
nanoLC-MS/MS, cette approche est devenue indispensable à l’électrophorèse pour l’identification des protéines.
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