HACE1 et le contrôle de la croissance cellulaire : impact de mutations ponctuelles d’hace1 retrouvées dans le cancer sur la croissance cellulaire ? Nouveau mode de régulation ?

Des études antérieures ont déjà impliqué l’activité E3 ubiquitine-ligase de HACE1 dans le contrôle de la prolifération cellulaire faisant pour certaines de ces études un parallèle avec la régulation des niveaux de Rac1 actif (Daugaard et al., 2013; Goka and Lippman, 2015; Zhang et al., 2007). En effet, Zhang et al. ont d’abord observé qu’HACE1 limite la prolifération de lignées cellulaires cancéreuses (SK- NEP-1 issues de tumeurs de Wilms’, des cellules IRM32 issues de neuroblastomes). De plus dans cette étude, les auteurs montrent qu’HACE1 limite la croissance cellulaire en réduisant les niveaux cellulaires de la cycline D1, contrairement aux cyclines A, B et E, et sans que la cycline D1 soit une cible de son activité E3 ubiquitine-ligase (Zhang et al., 2007). Rac1 est un régulateur majeur de l’expression et stabilité et de la cycline D1 (Joyce et al., 1999; Musgrove et al., 2011; Ridley, 2001a). Par la suite, l’équipe du Dr Sorensen en collaboration avec notre équipe, a pu expliquer le lien entre HACE1 et la régulation de la cycline D1. L’activité E3 ubiquitine-ligase d’HACE1 en régulant les niveaux de Rac1 actif, entraine l’inhibition de l’activité de la NADPH oxydase qui est normalement requise par le facteur de transcription AP1 pour induire l’expression du gène de la cycline D1. De plus, la perte d’HACE1 dans les cellules entraine l’hyperactivation de la NADPH oxydase liée à l’accumulation de la forme active de Rac1. Cela est à l’origine d’une hyperproduction chronique des EAO et d’une augmentation du niveau de cycline D1 en réponse au stress oxydatif, entrainant une hyper prolifération cellulaire (Daugaard et al., 2013). Une dernière étude publiée par Goka et al. en 2015 conforte le rôle de l’activité E3 ubiquitine-ligase d’HACE1 dans sa capacité de contrôle de la prolifération des cellules cancéreuses. Les auteurs montrent qu’HACE1 est capable de limiter la croissance cellulaire en agar de cellules MCF-7 (lignées issues de cancer du sein) en lien avec son activité de poly-ubiquitylation dégradative de Rac1 et de régulation du niveau de Rac1 actif dans ces cellules (Goka and Lippman, 2015). L’activité de Rac1 est un élément essentiel à la croissance cellulaire. Les expériences visant à inhiber Rac1 en condition de déplétion de HACE1 pour montrer un effet de blocage du cycle ne permettent pas de démontrer formellement qu’HACE1 régule la croissance via sa capacité à contrôler Rac1. Pour aller plus en avant dans ces questions, nous avons analysé l’effet sur la croissance cellulaire de mutations ponctuelles de type « faux-sens » d’HACE1. Ceci devait nous renseigner sur le lien entre HACE1 et Rac1 dans la croissance et permettre de définir des positions essentielles d’HACE1 impliquées dans son association à Rac1. De plus, s’il est établi un lien génétique précis entre la modulation de l’expression de certaines E3 ubiquitine-ligases à domaine HECT et le cancer, la présence de mutations ponctuelles « délétères » de ce type d’E3L dans la cellule cancéreuse est peu documentée à ce jour (Chen and Matesic, 2007).

Nous avons donc émis l’hypothèse que des mutations ponctuelles d’HACE1 - situées en dehors du domaine catalytique - retrouvées dans le cancer peuvent avoir un impact sur sa capacité de contrôle de la prolifération cellulaire et la régulation de Rac1. L’approche originale que nous avons utilisée consistait à utiliser les informations d’une base de données de séquençage des tumeurs versus tissu sain, et notamment en recensant les mutations somatiques et « faux-sens » d’HACE1 associées à différents types de cancer. L’analyse de la base de données COSMIC version 64 nous a permis dans un premier temps d’identifier 13 mutations somatiques faux sens, hors domaine HECT, c’est-à-dire dans les domaines ANK (9 mutations) et MID (4 mutations) de la protéine (acides aminés 1-545). Parmi ces 13 mutations : 7 (54%) étaient issues d’adénocarcinomes coliques, 3 (23%) d’adénocarcinomes ovariens, 2 (15%) de cancers épidermoïdes cutanés et 1 (8%) d'un adénocarcinome pancréatique.

Nous avons établi des lignées cellulaires exprimant chacune des formes mutées d’HACE1 pour déterminer leur impact sur la croissance par comparaison à la forme sauvage de HACE1. Une étude précédente menée par Goka et al. avait montré qu’une perte d’expression d’HACE1 dans des cellules épithéliales mammaires de type MCF12A entraine une augmentation de Rac1 actif entrainant une hyperprolifération cellulaire (Goka and Lippman, 2015). Nous avons donc initialement utilisé des lignées cellulaires MCF12A pour réaliser nos expériences. De façon remarquable, 100% des mutations testées (13/13) suppriment la capacité d’HACE1 à freiner la croissance cellulaire. En effet, en utilisant le test colorimétrique XTT pour la mesure de la prolifération cellulaire, nous avons observé que des cellules MCF12A exprimant stablement HACE1 mutée prolifèrent significativement plus vite que les cellules contrôles surexprimant la forme sauvage d’HACE1. Cette perte de fonction « suppresseur de croissance » d’HACE1 induite par les mutations ponctuelles du cancer a été confirmé pour 100% des mutations altérant l’activité E3L d’HACE1 envers Rac1 (4/4) (cf paragraphe II.2) : (i) en XTT en utilisant deux autres types de lignées cellulaires : MCF7 - lignée cellulaire tumorale d’adénocarcinome mammaire - et NIH/3T3 - lignée de cellules embryologiques fibroblastiques et (ii) en réalisant des tests de prolifération en « soft agar » (agar mou) sur des lignées MCF7. L’ensemble de ces résultats suggère que des mutations d’HACE1 identifiées dans les cancers ont un rôle promoteur « driver » sur la croissance des cellules plutôt qu’un rôle passif « passenger ». Ce rôle était jusqu’alors inconnu. Etant donné que Rac1 promeut la croissance cellulaire, cela soulevait la question de l’impact fonctionnel de ces mutations sur l’activité E3 ubiquitine-ligase de HACE1 envers sa cible Rac1.

II.2 Lien entre les mutations ponctuelles d’hace1 du cancer et son activité E3 ubiquitine-