Les RDHs sont des enzymes dont la localisation rétinienne n’est plus à démontrer [106, 133, 180]. Toutefois, leur implication dans la fonction visuelle n’est pas totalement comprise et leur structure tridimensionnelle n’a pas encore été résolue. De plus, les mécanismes qui régissent l’interaction de ces enzymes avec les membranes demeurent inconnus. L’objectif principal de ces travaux de recherche a été alors d’obtenir principalement des informations structurales et d’interaction membranaire pour la RDH8, qui sert donc de modèle d’étude pour tirer des conclusions plus générales sur les caractéristiques structurales et de liaison membranaire de cette famille d’enzymes. Nous avons également approfondi notre étude de la liaison membranaire des RDHs en procédant à l’étude des segments qui permettent cette liaison. Nous avons alors étudié séparément deux segments N-terminaux de la RDH11 (Long-peptide et Short-peptide) qui différaient en termes de longueur ainsi que plusieurs versions du segment C-
terminal de la RDH8 (différentes longueurs, acylations, mutations). L’objectif de cette approche utilisant des segments peptidiques étant de comparer la conformation de ces segments et leur comportement interactionnel pour mieux comprendre les modèles de liaison membranaire des RDHs, surtout que la topologie membranaire postulée dans la littérature pour la RDH11 [148-150] et la RDH8 [93, 136] n’est pas similaire.
Les objectifs de recherche sont donc les suivants:
- Étudier la liaison membranaire des segments peptidiques en N- et C-terminal qui permettent respectivement la liaison de la RDH11 et la RDH8 aux membranes des cellules rétiniennes.
- Cloner, surexprimer et purifier la RDH8 et sa forme tronquée (RDH8t, sans son segment C-terminal).
- Caractériser la structure secondaire et la liaison membranaire de la RDH8 et la RDH8t.
- Déterminer l’impact du segment C-terminal sur la stabilité de la RDH8 et la RDH8t. Dans un premier temps, après avoir optimisé la solubilité des différentes formes des segments N- et C-terminaux qui permettent respectivement la liaison de la RDH11 (chapitre 2) et la RDH8 (chapitre 3), ces peptides ont été étudiés avec le système des monocouches de Langmuir afin de déterminer leur pression d’insertion maximale (PIM) et leur synergie en présence de différents types de phospholipides. Leur structure a été également caractérisée par spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) et infrarouge (IR). L’étude spectroscopique par IR de ces segments seuls a été faite en solution (ATR) ainsi qu’en présence de monocouches lipidiques (PM-IRRAS).
Pour ce qui est de l’étude de la RDH8, plusieurs tentatives de clonage, surexpression et purification ont été nécessaires avant d’obtenir la protéine purifiée (voir section 5.3). Le détail du protocole adopté pour obtenir la RDH8 purifiée est décrit dans le chapitre 4. Le même protocole a été utilisé pour la purification de la RDH8t.
L’étude de la structure secondaire de la RDH8 et la RDH8t a été effectuée par des méthodes computationnelles (I-TASSER) avant d’être analysée par spectroscopie CD et IR. Les données de PM-IRRAS ne seront pas présentées dans le cadre de cette thèse car les mesures préliminaires effectuées n’étaient pas concluantes. Par contre, la présence spécifique de tryptophanes dans la portion C-terminale de la RDH8 (W289,
W302) et la RDH8t (W289) a permis des analyses plus poussées permettant d’obtenir des informations supplémentaires intéressantes quant à la conformation et la liaison membranaire médiée par le segment C-terminal de la RDH8.
L’interaction membranaire des deux formes de la RDH8 (complète et tronquée) a été également comparée par des mesures de pression de surface en présence de différents types de phospholipides, afin de déduire les caractéristiques qui régissent leur liaison membranaire. De plus, l’effet de la délétion du segment C-terminal de la RDH8 a été étudié en corrélation avec la stabilité de cette enzyme. Une analyse comparative de la stabilité des deux formes a été donc effectuée dans le temps en fonction de la température de conservation et également en fonction de la température, pour mieux comprendre l’impact du segment C-terminal sur la RDH8.
Si les conditions de purification de la RDH8 (et la RDH8t) s’avèrent être satisfaisantes et les quantités obtenues suffisantes pour l’ensemble des analyses incluses dans cette thèse, il faut toutefois essayer de maximiser les rendements et optimiser les protocoles afin d’obtenir des quantités maximales en protéine pour procéder à l’étape suivante : la détermination de la structure tridimensionnelle de la RDH8 par des études de diffraction aux rayons-x des cristaux protéiques ou par résonance magnétique nucléaire (RMN). Des essais de cristallisation pourraient alors être entrepris par notre professionnelle de recherche, Line Cantin, en parallèle avec des mesures préliminaires de spectres HSQC en RMN 2D (en collaboration avec le Dr Stéphane Gagné).
Le test d’activité enzymatique optimisé pour la RDH11 (thèse de M. Méthot), que j’ai reproduit au début de mon projet de recherche, devra également être adapté plus spécifiquement pour caractériser l’activité enzymatique de la RDH8, car les deux enzymes diffèrent fondamentalement dans leur fonctionnalité catalytique : la fonction de la RDH11 est postulée d’être l’oxydation du 11-cis rétinol en 11-cis rétinal [147, 148] alors que la RDH8 réduit le tout-trans rétinal en tout-trans rétinol [91-93]. Il faudra donc tenir compte de ces propriétés dans le choix des conditions pour effectuer le test d’activité : type de cofacteurs, substrats, pH, température, durée, etc. La caractérisation de l’activité enzymatique de la RDH8 constitue un projet de recherche distinct qui a déjà été pris en charge par un nouveau membre du laboratoire.
Chapitre 2 Structure of the N-terminal segment of
human retinol dehydrogenase 11 and its preferential
lipid binding using model membranes
Article publié dans Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes, 1848 (2015) 878–885
Mustapha Lhor, Mario Méthot, Habib Horchani, Christian Salesse*
CUO–Recherche, Hôpital du Saint-Sacrement, Centre de recherche du CHU de Québec and Département d’ophtalmologie, Faculté de médecine, and Regroupement stratégique PROTEO, Université Laval, Québec (Québec) Canada.
Key words: retinol dehydrogenase 11; N-terminal anchoring peptide, monolayer; protein
secondary structure; maximum insertion pressure; retinal pigment epithelium.
*Correspondence: Dr. Christian Salesse, CUO–Recherche, Centre de recherche du
CHU de Québec, Hôpital du Saint-Sacrement, 1050 Chemin Ste-Foy Québec (Québec), Canada G1S 4L8. Phone: (418) 682-7569; Fax: (418) 682-8000; E-mail: christian.salesse@fmed.ulaval.ca