3.1- Construction d’une banque enrichie en microsatellites L’ADN génomique de 4 échantillons prélevés en Mer de Wadden (Pays-Bas) a

été extrait à partir d’environ 15 mg de muscle avec un kit Nucleospin tissue (Macherey Nagel). Une banque génomique de microsatellites, enrichie en motifs CA a ensuite été construite en suivant le protocole décrit par Billote et al (1999)(protocole détaillé en Annexe A). Brièvement, l’ADN total de chaque individu (environ 10 µg) a été digéré par l’enzyme RsaI (Promega) pendant 7h à 37°C . Les 4 ADN digérés ont ensuite été mélangés deux à deux et purifiés sur une colonne Nucleospin® (Macherey Nagel) avant d’être ligué à des adaptateurs RsaI permettant l’amplification par PCR des fragments obtenus. Le programme PCR consistait en une première phase de dénaturation de 4 min à 95°C suivi de 20 cycles de 30 s à 94°C, 1 min à 60°C et 1 min 30 à 72°C, terminé par une phase d’élongation finale de 5 min à 72°C.

L’enrichissement de la banque en motif AC a été réalisé grâce à un oligonucléotide biotynilé (AC)10 qui a permis de sélectionner les fragments d’ADN porteurs de ce motif. Ces fragments ont ensuite étés triés grâce à des billes magnétiques recouvertes de streptavidine (Streptavidin Magnesphere® Paramagnetic Particles; Promega) et isolés par lavages successifs de tampon SSC (Saline Sodium Citrate).

La fraction enrichie a ensuite été purifiée, amplifiée (Annexe A) et liguée dans un plasmide pGEM®-T easy (Promega). Ces plasmides ont ensuite été clonés dans des bactéries compétentes d’Escherichia coli DH5α. Les bactéries transformées (c’est à dire contenant le plasmide) ont ensuite été mises en culture sur du milieu LB-agar (Luria Broth) en présence d’ampicilline, d’IPTG et de Xgal, ces trois produits permettant de s’assurer d’une part que les bactéries contenaient bien le plasmide (résistant à l’ampicilline) mais aussi que le plasmide contenait bien l’insert (le fragment d’ADN enrichi en motif AC). Les colonies blanches (Annexe A) ont ensuite été repiquées en milieu LB liquide puis amplifiées par PCR avec les amorces spécifiques du plasmide pGEM®-T easy (Promega) afin de confirmer la présence de l’insert.

Chaque clone positif a ensuite été extrait avec un kit Nucleospin Plasmid Quick

Pure de Macherey-Nagel selon le protocole du fournisseur. La concentration en ADN ainsi

que la pureté ont ensuite été évaluées par mesure de la DO à 260 et 280 nm grâce à un spectromètre.

48

I.3.2- Séquençage et sélection des marqueurs microsatellites

Sequencing Kit (Epicentre) sur un séquenceur à plaques Li-Cor NEN Global IR2 . Ce

séquençage a permis de sélectionner les motifs microsatellites les plus pertinents (motif assez long et non entrecoupé, espace disponible de part et d’autre pour la définition d’amorces, Figure I.1).

Figure I.1: Représentation schématique d’un fragment d’ADN de Macoma balthica obtenu par séquençage d’un clone positif : cas de figure idéal laissant un grand choix pour la définition d’amorces de part et d’autre du motif microsatellite situé au milieu du fragment d’ADN séquencé.

Les amorces ont été dessinées avec le logiciel OLIGO® v.6.0 (Rychlik & Rychlik 2000) et les amorces sens (F) ont été marquées avec une molécule fluorescente IRD700TM ou IRD800TM. Chaque couple d’amorce a été testé sur 36 individus issus de deux populations éloignées géographiquement (15 individus de Fouras en France et 21 individus de la Mer de Wadden en Hollande) afin d’optimiser le choix des marqueurs microsatellites. La réaction d’amplification a été réalisée dans un volume final de 10 µl contenant environ 50 ng d’ADN, 0,25 µM d’amorce sens marquée en fluorescence, 0,25 µM d’amorce anti-sens non marquée, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de chaque dNTP, du tampon PCR 1X et 0,5 U de Thermoprime Plus DNA Polymerase (ABgene). La réaction a été réalisée sur un thermocycleur MJ Research PTC-200 (MJ Research Inc.) avec un programme dit

touchdown qui permet d’obtenir plus facilement la bonne température d’hybridation. Ce

programme se décomposait ainsi: 3 min de dénaturation initiale à 95°C, suivi par 10 cycles consistant en une phase de dénaturation de 45 s à 95°C, une phase d’hybridation de 45 s à une température diminuant de 1°C à chaque cycle d’une température initiale Ti à une température finale Tf (Table I.1), puis une phase d’élongation de 45 s à 72°C. Ces 10 cycles étaient suivis de 30 cycles de 45 s à 95 °C, une hybridation de 45 s à Tf, une élongation de 45 s à 72°C suivi d’une phase finale d’élongation de 7 min à 72°C

49 Fouras (N =15) Waddensee (N =21)

Genbank accession

no. ^{Locus Core Sequence Primer sequences (5'-3')}

Ti-Tf

(C°) ^{Allele size} range (bp) ^{Ntall Nall He Ho Fis Nall He Ho Fis} EU 676331 ^Mb-mac ₄ (TG)4CG(TG)3CA(TG)4 F: CTCATATCTTCACCCTAGA 66-56 395-443 18 14 0,9 0,73 0,222 13 0,87 0,33 0,634

R: CCATTTCCTGTCATTAGCA (P = 0,0000)

EU 676330 ^Mb-mac ₁₀ (TG)5GA(TG)2(TA)2(TG)7AC(TG)2 F: GGGTGTTGATGGGATAATA 66-56 396-404 5 5 0,69 0,33 0,542 4 0,64 0,41 0,786

R: TGGGGGCTACGAATAAGT (P = 0,0027)

EU676332 ^Mb-mac ₁₇ (TG)14 F: TGTGGGATTTGAGATTTTTA 62-52 529-581 26 14 0,89 0,53 0,433 19 0,93 0,71 0,257

R: TACATTTATTTTCATTCACGAT (P = 0,0000)

EU 676333 ^Mb-mac ₁₉ (TG)7CG(TG)2AGTGACC(TG)2 F: TCTTCTTTATGTAGCGTGTT 64-54 331-373 17 14 0,91 0,8 0,154 12 0,88 0,52 0,427

R: CCAGGGCGAGTTTTTCTT (P = 0,0409)

EU 676334 ^Mb-mac ₄₀ (CA)5 F: GTGCGGACAAGAATACG 64-54 199-211 6 5 0,39 0,27 0,356 3 0,25 0,14 0,457

R: TATTGGCTGTGCTCGGTTT (P = 0,3380)

EU 676335 ^Mb-mac ₆₄ (TG)5 F:ATAATTTGTGGGGTTGAGGT 66-56 168-184 6 6 0,48 0,47 0,071 2 0,32 0,2 0,419

R: GTTTCGAGTTTCGCAGTCA (P = 0,1726)

EU 676337 ^Mb-mac ₈₄ (CA)5 F: TATATCCCTTGATCGGTTT 64-54 248-280 8 7 0,8 0,33 0,607 4 0,55 0,32 0,446

R: ACGTATGTTTTTGTCCATGT (P = 0,0000)

GQ 406063 ^Mb-

macB3-24 ^{(CA)4CG(CA)4 F: AGATACGGACAGATTAACTAC 68-58 332-352 7 5 0,35 0,2 0,451 6 0,49 0,33 0,344}

R: CGGACTCGGGTGTATGTAA (P = 0,0380)

Tableau I.1: Caractéristiques des huit marqueurs microsatellites isolés à partir de Macoma balthica (Numéro d’accession Genbank: EU676330-EU676337 and GQ 406053).Ti et Tf sont les températures d’hybridation initiales et finales de la PCR touchdown. NTall et HT: nombre d’ alleles et hétérozygotie totale pour l’ensemble de l’échantillon (N=36), Nall et HE: nombre d’ alleles et heterozygotie attendue à l’échelle de la population, FIS: estimation de l’écart à l’équilibre de Hardy-Weinberg et P associées (test exact).

50 L’électrophorèse des produits PCR a ensuite été réalisée sur gel de polyacrylamide à 6,5% sur un séquenceur Li-Cor NEN Global IR2. Les marqueurs ont été retenus en fonction de leur polymorphisme intra et interpopulation.

L’indépendance des loci entre eux a été testé pour chaque paire de loci sur l’ensemble des populations avec le logiciel GENEPOP version 4.0.7 (Raymond et Rousset 1995), ceci en suivant une processus de MonteCarlo à Chaines de Markov avec les paramètres suivants: Dememorization number : 1000, Batch number : 100, Iteration per batch : 1000. Ce logiciel a également été utilisé pour estimer le nombre d’allèles sur l’ensemble des populations (Ntall) et au sein de chaque population (Nall), le taux d’hétérozygotie attendue à l’équilibre de Weinberg (He), le taux d’hétérozygotie observée et le déficit en hétérozygote (Fis). La présence d’allèles nuls a également été testée avec le logiciel MICRO-CHECKER v.2.2.3 (Van Osterhout et al 2004)