Notre étude de la diversité ECM dans les aulnaies s’est appuyée sur deux grands types de données brutes : (i) des relevés de carpophores et d’ectomycorhizes à partir desquels nous avons établis les relations de spécificité champignon-hôteet (ii) des relevés de sol dans les sites étudiées.
I- 1 – Récolte des spécimens et identification des espèces présentes :
* Carpophores :Les carpophores utilisés dans notre étude proviennent en grande partie des récoltes intensives menées par Pierre-Arthur Moreau dans des aulnaies largement distribuées en France métropolitaine (notamment via le « projet aulnaies »18) et en Europe (Autriche et Suisse principalement). Ceux-ci ont été collectés, photographiés et décrits rapidement après collecte puis conservés sous la forme d’exsiccatas à l’herbier de la faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques de Lille (LIP) et/ou dans du tampon CTAB
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en vue d’analyses moléculaires ultérieures. Au total, ce sont plus de 600 spécimens qui ont été récoltés. Ces carpophores ont été identifiés sur la base de caractères morphologiques, anatomiques et écologiques (taxonomie mycologique traditionnelle) en suivant la nomenclature valide (voir plus loin pour chaque groupe taxonomique concerné). En parallèle, leur ADN a été extrait et un ou plusieurs marqueurs ont été amplifiés et séquencés : l’ITS pour l’ensemble des spécimens, auquel se sont ajoutés 3 marqueurs (cf.
tableau 6) en vue de la reconstruction de phylogénies pour quatre des groupes ECM dominants dans les
aulnaies.
Ainsi, pour chaque spécimen, les informations suivantes étaient précisées : nom d’espèce (provisoire puis définitif) ; plante hôte ; localisation géographique ; marqueurs moléculaires séquencés (voir tableau 6) ; code des séquences ADN pour chaque marqueur séquencé ; numéro dans l’herbier ; numéro d’accession dans la GenBank après dépôt de la séquence (voir extrait de la base de données ainsi constituée en annexe 2)
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http://projet.aulnaies.free.fr/presentation.html
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Tampon CTAB 2X : 100 mM Tris–HCl (pH 8), 1.4 M NaCl, 20 mM Na2 EDTA, 2% CTAB)
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* Ectomycorhizes :
Au total, plus de 4400 ectomycorhizes ont été prélevées sur 39 sites répartis sur 3 grandes régions françaises sur le système racinaire des 4 espèces d’aulnes présentes en France, (voir tableau 4) selon un protocole présenté dans l’article 2.
L’ADN de chaque mycorhize a été extrait puis le marqueur ITS (cf. encart p50) a été amplifié et séquencé (protocole présenté dans l’article 2). Les séquences ITS obtenues pour toutes les mycorhizes ont été groupées en Unités Taxonomiques Opérationnelles Moléculaires ou MOTUs, c'est-à-dire en groupes de séquences similaires à plus de 97%, et considérés par la suite comme des « espèces moléculaires » (voir encart).
L’objectif de cette double approche était d’exploiter le plus finement possible la complémentarité entre les données de la classification traditionnelle (établies ici à partir des carpophores seuls) et les résultats de taxonomie et phylogénies moléculaires (appliquées aux ectomycorhizes et carpophores) pour la description de la diversité des communautés ECM. Le travail qui consiste à s’assurer de la congruence entre les données de diversité issues de ces deux approches parait indispensable20 et trivial : en produisant des séquences ITS pour des carpophores identifiés selon les principes de la taxonomie traditionnelle et des ectomycorhizes, la comparaison des séquences permet potentiellement de faire correspondre à chaque échantillon d’ectomycorhize le nom de l’espèce morphologique à laquelle il correspond, permettant d’attribuer à chaque MOTU issue d’échantillons environnementaux un nom d’espèce et les données écologiques qui lui sont associées grâce aux études mycologiques traditionnelles.
Cependant la réalité est plus complexe et la calibration de ce système a constitué un travail conséquent afin d’évaluer la pertinence des informations collectées lors des analyses morphologiques et moléculaires. Ainsi, la construction de notre base de données a ainsi été processus dynamique et très progressif
I- 2- Caractérisation des patrons de spécificité d’hôte des champignons ECM des
aulnaies
A partir des relevés de diversité dans les cortèges ECM d’aulnaies françaises, nous avons cherché à caractériser chaque espèce fongique en fonction de l’état du caractère « spécificité d’association avec l’hôte ». Pour celui ci nous avons ainsi défini quatre états possibles
- généraliste, pour des espèces capables de s’associer avec des représentants du genre Alnus mais aussi d’autres espèces hôtes (principalement genres Populus, Salix, Quercus, Picea, pour les sites étudiés)
- alnicole au sens large, pour des espèces recontrées seulement en association avec les aulnes et capables de s’associer avec tous les représentants du genre Alnus présents en France
- spécifique d’un sous-genre donné à l’intérieur du genre Alnus : Alnobetula ou Alnus (voir Chen et Li, 2004)
20C’est le principe de base du barcoding qui est désormais un grand classique des études des communautés microbiennes entre autres (Valentini et al., 2009 ; voir encart)
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- spécifique d’une espèce donnée (Alnus glutinosa, A. alnobetula spp alnobetula, A. alnobetula spp
suaveolens, A. incana ou encore A. cordata)
Nos hypothèses de travail étaient les suivantes : (i) une espèce ECM X est considérée comme spécifique d’un taxon hôte Y dès lors que tous les signalements espèce X + hôte Y sont convergents (données carpophores et mycorhizes) (ii) la taille de notre échantillonnage nous permet de considérer les données nulles (absences d’une espèce) comme significatives, au moins pour les espèces ne posant pas de problème d’échantillonnage et de séquençage.
I-3- Caractérisation des sols des sites d’étude
En parallèle, des relevés de sols sur les sites d’étude ont permis de les caractériser par rapport à leurs teneurs en éléments connus pour influencer la structure et la diversité des communautés de plantes et de leurs partenaires ECM (teneurs en azote, phosphore, matière organique totale) et selon des protocoles comparables à ceux de l’étude Tedersoo et al. (2009). A chaque point de prélèvement d’ectomycorhizes, des relevés de sol étaient effectués. Ces échantillons ont ensuite séchés puis groupés par site, en vue d’analyses chimiques ultérieures pour une caractérisation édaphique à l’échelle de chaque site..