Conservation et entretien des cellules

2.1. Congélation/Décongélation des cellules

Afin d’éviter toute contamination des cultures cellulaires par des bactéries et des champignons, toutes les manipulations sont effectuées en condition d’asepsie.

Ces quatre lignées sont conservées dans plusieurs cryotubes stériles plongés dans de l’azote liquide (-196 °C). Lors de la décongélation, un milieu dit de décongélation est préalablement préparé et chauffé à 37 °C (Fig. MM3). Le cryotube contenant les cellules est ensuite décongelé rapidement par des passages rapides dans le bain-marie puis est resuspendu dans 2 ml de milieu de décongélation afin de diluer le DMSO très toxique pour les cellules présent dans le milieu de conservation. Les cellules sont ensuite mises en présence de 10 ml de milieu

119 surface favorise l’adhésion cellulaire.

Les cellules sont ensuite placées dans un incubateur à 37 °C sous une atmosphère saturée en humidité avec 5 % de CO2 et 95 % d’air. Les cellules sont alors dans un environnement favorable à leur développement. Après 24 h d’incubation, le milieu de décongélation est remplacé par le milieu de prolifération afin d’éliminer toutes traces de DMSO. Le milieu de prolifération est riche en sérum de veau fœtal pour favoriser la prolifération des cellules grâce aux facteurs de croissance, aux vitamines. La concentration finale en calcium dans ce milieu est faible défavorisant alors la fusion des myoblastes. Lorsqu’elles ont atteint un niveau de confluence de 60 %, les cellules sont alors repiquées.

120 cryotube à l’aide d’un milieu de congélation à 4 °C (Fig. MM3) puis entreposées dans une boîte de congélation toute une nuit à -80 °C permettant alors un refroidissement délicat d’un degré par minute pour éviter tout choc thermique et donc limiter la mort cellulaire. Le lendemain, les cryotubes sont mis à -196 °C dans l’azote liquide.

2.2. Le repiquage des cellules (trypsinisation et ensemencement)

Afin d’entretenir les cellules et d’éviter l’initiation de la fusion, les cellules sont repiquées de manière régulière. Il est important de préciser que le degré de confluence ne doit pas dépasser 80 % car, dans ce cas, les cellules rentrent dans la phase de différenciation et perdent leur capacité de prolifération. A 60 % de confluence, les cellules subissent une dissociation enzymatique en présence de 2 ml de trypsine-EDTA (Gibco), enzyme protéolytique, pendant une minute. Le milieu est ensuite aspiré puis le flacon placé dans l’incubateur pendant 5 min afin de faciliter le décollement des cellules du flacon en plastique. Le bon décollement des cellules est contrôlé grâce à un microscope inversé. Elles sont alors resuspendues par aspiration et refoulement dans 5 ml de milieu de prolifération. Les cellules sont ensuite comptées sur cellule de Malassez et sont ensemencées dans des plaques 6 puits contenant des lamelles en verre gélatinées (gélatine 1 % (Sigma-Aldrich) de 30 mm de diamètre ou dans des plaques 12 puits contenant des lamelles en verre gélatinées de 18 mm de diamètre pour des études calciques ou d’immunomarquages à F+3 et F+4 (trois et quatre jours après la promotion de la fusion des myoblastes). Pour l’entretien, les cellules sont ensemencées dans de nouveaux flacons de routine à compter de 150 µl complétés avec 5 ml de milieu de prolifération par flacon pour une confluence trois jours après. A chaque repiquage, les cellules peuvent perdre certaines caractéristiques, elles sont donc repiquées une vingtaine de fois maximum.

2.3. La différenciation des cellules

Les études se font essentiellement sur des cellules différenciées en myotubes à F+3 et F+4, stade où la (mini-)dystrophine est correctement adressée à la membrane. Les cellules confluentes peuvent amorcer la différenciation mais celle-ci est accélérée sous l’influence d’un milieu de fusion (encore appelé milieu de différenciation) présentant une augmentation de la concentration en calcium, une suppression du sérum de veau fœtal et l’introduction de sérum de cheval (Fig. MM3). Les cellules, accolées entre elles par contact entre leurs membranes, fusionnent pour donner des myotubes polynuclées.

121 La culture de cellules consiste à maintenir hors de l’organisme, dans un milieu proche des conditions physiologiques, des cellules capables de se diviser et/ou de conserver un métabolisme et des fonctions spécifiques observées in vivo. L’isolement des cellules organisées en tissu requière des méthodes fondées sur la dissection et la digestion enzymatique du tissu d’origine. Dans le muscle néonatal de souris, une grande partie des précurseurs myogéniques prélevés est constituée d’une population particulière de myoblastes: les cellules satellites. Elles se trouvent étroitement accolées aux fibres sous la lame basale et l’endomysium qui entourent la fibre musculaire et assurent la croissance et la régénération musculaire. Leurs comportements in vitro rappellent les étapes de différenciation in vivo et ainsi elles nous permettent d’en étudier les mécanismes. Le but est de prélever, de dissocier et de mettre en culture les cellules satellites provenant des muscles des pattes postérieures de souris de la souche C57BL/10 et de souris mdx âgées de 3 à 6 semaines. Les cellules satellites mises en culture sont ainsi capables de proliférer, de s’aligner, de fusionner et enfin de présenter les caractéristiques du muscle différencié.

La souris est tout d’abord euthanasiée par dislocation cervicale puis lavée au savon bactéricide et à l’alcool iodé. Une incision de la peau est effectuée au niveau des pattes postérieures afin de mettre en évidence les muscles. Les muscles sont alors prélevés sans tissu conjonctif, ni tendons. Ceux qui nous intéressent sont le muscle soléaire (muscle lent à métabolisme oxydatif), le gastrocnémien, l’EDL (Extensor Digitorum Longus: muscle rapide à métabolisme glycolytique), le tibialis et le quadriceps. Ils sont ensuite déposés dans du PBS (Phosphate Buffer Saline: NaCl 130 mM; KCl 2,07 mM; Na2HPO4 1,5 mM; KH2PO4 8 mM) stérile chaud supplémenté de 1 % d’antibiotiques (Pénicilline/Streptomycine) (Sigma- Aldrich). Le PBS ne contient ni Ca2+ ni Mg2+ permettant ainsi une dissociation grossière puisque l’absence de ces deux cations divalents favorise la dissociation tissulaire en déstabilisant les liaisons intercellulaires. Les muscles ainsi disséqués, sont découpés en petits morceaux pour faciliter l’action des enzymes de digestion et nettoyés afin d’éliminer les tendons et amas graisseux. Des étapes de centrifugation sont nécessaires pour éliminer les cellules autres que musculaires telles que les cellules sanguines, les ostéoblastes et ostéoclastes, les débris de cellules mortes etc. Les morceaux de muscles subissent une dissociation enzymatique pendant 45 min à 37 °C sous agitation. La solution enzymatique contient 1,5 mg/ml de collagénase de type I (Sigma-Aldrich), 2 mg/ml de protéase de type IV (Sigma-Aldrich) diluées chacune dans 10 ml de Ham’s F-12 (Lonza), 300 µl d’HEPES et de Pénicilline/Streptomycine stériles. Les enzymes protéolytiques vont digérer la membrane

122 dissociation est suffisante, d’autres étapes de centrifugation (5 min à 90 g) et de filtration (filtre 21 µm) sont réalisées. Subséquemment, les cellules musculaires sont mélangées dans du milieu de prolifération (Fig. MM4) adapté à ce type cellulaire afin de neutraliser l’action des enzymes et de stopper la digestion et subissent une étape de pré-ensemencement (preplating) d’une durée de 45 min à 37 °C. Cette dernière étape permet d’éliminer une grande partie des fibroblastes qui ont la propriété d’adhérer plus rapidement au support en plastique. Le surnageant est récupéré puis ensemencé dans des flacons à bouchon ventilé.

Durant les premières heures d’ensemencement, les cellules arrondies vont adhérer progressivement au fond des flacons. A ce stade, les myoblastes sont difficilement discernables des fibroblastes qui n’ont pas pu être entièrement éliminés lors du preplating. Peu à peu les cellules arrondies deviennent fusiformes avec un cytoplasme réduit et un noyau

123 s’alignent et forment un tapis cellulaire. Lorsque les cellules atteignent un niveau de confluence important, elles peuvent alors être repiquées (protocole similaire à celui des lignées). Pour les mesures calciques, les myoblastes sont ensemencés dans des plaques 6 puits sur des lamelles de 30 mm de diamètre préalablement traitées avec du Matrigel (BD Biosciences) au 1/20ème. Les concentrations des cellules sont en général entre 150 000 et 300 000 cellules par puits. La différenciation terminale est favorisée par un milieu de fusion (Fig. MM4) adapté à ce type cellulaire. Durant les trois premiers jours de différenciation, les myotubes possèdent des noyaux en position centrale. Dès le quatrième jour, il est possible d’observer des myotubes présentant des contractions spontanées. Au cours du temps, ces myotubes se développent et les noyaux sont repoussés à la périphérie. Des striations alignées correspondant aux protéines sarcomériques apparaissent dans l’axe transversal des myotubes. L’activité des myotubes est mesurée à F+6 (6 jours après promotion de la fusion des myoblastes), stade où la dystrophine est adressée à la membrane. La durée de vie de la culture primaire dépend de la fréquence de contractions, qui, lorsqu’elle devient trop importante, entraîne le décollement des cellules du fond de la boîte.