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CHAPTER 9. CONFIGURING THE BASIC I/O SYSTEM
Após avaliação das propriedades de agregação e da citotoxicidade dos sistemas cataniónicos, foram selecionados os sistemas mais promissores para os estudos de encapsulação de doxorrubicina. Esta seleção foi feita de acordo com os valores de cac e de IC50 determinados. Assim, os sistemas cataniónicos selecionados foram: DDAB/SDDS, na fração molar x+ = 0.30 e 0.60; 12-6-12/SDS, na fração molar x+ = 0.30;
Antes de se realizar os estudos de encapsulação, os vesículos foram submetidos a um processo de extrusão com o objetivo de uniformizar a sua distribuição de tamanhos. O tamanho médio, bem como a carga superficial dos agregados extrudidos foram determinados por dispersão dinâmica de luz e potencial zeta. Na Tabela 3.19 encontram-se sumarizados os resultados obtidos por DLS.
Tabela 3.19 - Diâmetro hidrodinâmico médio (z-average) e desvio padrão associado, índice de polidispersão (PDI) e potencial zeta dos vesículos cataniónicos extrudidos.
Mistura cataniónica x+ z-average
/ nm
PDI Potencial zeta / mV DDAB / SDDS 0.30 101 ± 1 0.19 - 56 ± 1 DDAB / SDDS 0.60 75 ± 1 0.18 + 68 ± 2 12-2-12 / SDDS 0.40 68 ± 1 0.20 + 65 ± 2 12-6-12 / SDS 0.30 88 ± 2 0.11 - 48 ± 1 DTAB / 12Lys8 0.50 59 ± 3 0.19 - 64 ± 3
Assim, para todos os sistemas extrudidos, obteve-se uma distribuição de tamanho unimodal, com tamanhos médios compreendidos entre 60 a 100 nm e índice de polidispersão baixo (0.1 a 0.2). No que diz respeito ao potencial zeta, não se verificou alteração significativa comparativamente aos valores obtidos para os sistemas espontâneos (não extrudidos). Foram obtidos valores elevados (maiores do que 30 mV, em valor absoluto) indicativos de sistemas vesiculares com elevada estabilidade coloidal.
De modo a avaliar a estabilidade coloidal dos vesículos extrudidos ao longo do tempo, realizaram-se ensaios de DLS, durante 15 dias. A Figura 3.21 ilustra a variação do tamanho médio dos agregados vesiculares submetidos à extrusão, ao longo do tempo.
Verifica-se que, ao longo dos 15 dias de estudo, o tamanho médio dos agregados praticamente não sofreu alterações significativas (excetuando, possivelmente, uma ligeira tendência de aumento).
3.5.1. Ensaio de eficiência de encapsulação
Para os estudos de eficiência de encapsulação, foram testadas duas razões molares DOX-tensioativo (1:10 e 1:5). Para tal preparou-se a mistura DOX-tensioativo segundo dois métodos de preparação distintos. Tal como referido na seção experimental, o método 1 consistiu na adição de cloridrato de doxorrubicina às soluções contendo vesículos cataniónicos pré-formados e extrudidos, enquanto que o método 2 consistiu na adição de solução aquosa de cloridrato de doxorrubicina às soluções aquosas dos tensioativos individuais, antes da formação dos vesículos.
Verificou-se que para os sistemas DDAB/SDDS e x+ = 0.30, 12-6-12/SDS e x+=
0.30, e DTAB/12Lys8 e x+ = 0.50 ocorria precipitação, independentemente do método
de preparação 1 ou 2. Deste modo, o ensaio de eficiência de encapsulação foi apenas realizado para os sistemas DDAB/SDDS x+= 0.60 e 12-2-12/SDDS x+ = 0.40 através dos
dois métodos supracitados.
Após a incorporação da DOX nos vesículos dos sistemas referidos, procedeu-se à centrifugação das respetivas soluções através de unidades de filtração (Amicons®), tendo-se efetuado este processo duas vezes. Este procedimento, permite a separação da DOX livre em solução, que consegue atravessar os poros da unidade de filtração, dos agregados vesiculares com DOX encapsulada, que ficam retidos no filtro. Posteriormente, a solução contendo DOX livre e a solução vesicular com DOX Figura 3.21 - Variação do tamanho médio dos agregados vesiculares extrudidos ao longo de 15 dias.
encapsulada (ressuspendida) foram analisadas por espectrofluorimetria, por forma a determinar a percentagem de encapsulação.
3.5.1.1. Quantificação da doxorrubicina encapsulada
por espectrofluorimetria
Após a obtenção da curva de calibração de DOX solubilizada em água ultrapura (Figura 3.22), obteve-se os espectros de fluorescência das soluções vesiculares com DOX (ressuspendidas), das soluções de DOX livre (após filtração nos Amicon®) e dos vesículos vazios (ver Anexo 3). A partir do valor de fluorescência obtido para o comprimento de onda de emissão máximo da doxorrubicina nas condições de estudo, 595 nm, determinou-se a quantidade de DOX presente nos complexos DOX-tensioativo, por extrapolação da reta de calibração. De seguida, procedeu-se ao cálculo da percentagem de encapsulação de acordo com a expressão apresentada na seção experimental.
Os resultados obtidos da quantificação, mostram que foi possível a encapsulação de DOX por parte dos dois sistemas cataniónicos em estudo, para a razão molar DOX/tensioativo 1:5, e apenas através do método de preparação 1. Por outro lado, o método de preparação 2, não possibilitou a encapsulação de DOX, obtendo-se percentagens de encapsulação residuais. Para o sistema DDAB/SDDS e x+= 0.60
obteve-se uma percentagem de encapsulação de 49%, enquanto que para o sistema 12-2-12/SDDS e x+ = 0.40 a percentagem de encapsulação foi apenas de 17%. (ver
Tabela 3.20)
Posteriormente, avaliou-se o tamanho médio e o potencial zeta dos sistemas DDAB/SDDS x+= 0.60, e 12-2-12/SDDS x+ = 0.40, com DOX encapsulada. Tal como se
pode verificar, após o processo de encapsulação, os agregados vesiculares apresentaram tamanho médio superior quando comparados com os dos vesículos originais (sem DOX). Esta alteração no tamanho médio dos agregados é mais pronunciada para o sistema que apresentou menor percentagem de encapsulação (DOX-12-2-12/SDDS e x+ = 0.40). Por outro lado, o valor do potencial zeta deste sistema
com DOX encapsulada (+51 ± 1 mV), não sofreu uma alteração muito significativa quando comparado com o valor obtido para os respetivos agregados vesiculares sem DOX (+ 65 ± 2 mV). Este resultado, sugere que a doxorrubicina encapsulada possivelmente se encontra, maioritariamente, dissolvida na cavidade aquosa dos vesículos.
Quanto ao sistema DOX-DDAB/SDDS x+ = 0.60, o seu valor de potencial zeta é
significativamente diferente antes (+ 68 ± 1 mV) e após encapsulação (+ 35 ± 3 mV). Esta diminuição do valor de potencial zeta, poderá significar que a doxorrubicina se encontra adsorvida à superfície do agregado ou até mesmo entre as bicamadas, causando um rearranjo estrutural desta, de modo a que o tensioativo aniónico se localize mais à superfície do agregado e que tal possa contribuir para diminuir a carga efetiva do agregado.
Tabela 3.20 - Diâmetro hidrodinâmico médio e desvio padrão associado, potencial zeta e eficiência de encapsulação de DOX por parte dos sistemas cataniónicos DDAB / SDDS x+= 0.60 e 12-2-12 / SDDS x+ =
0.40. Mistura cataniónica x+ Tamanho médio / nm Potencial zeta / mV Eficiência de encapsulação / % DDAB / SDDS 0.60 139 ± 2 + 35 ± 3 49 % 12-2-12 / SDDS 0.40 301 ± 1 + 51 ± 1 17 %