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1.6.1. Cultura Celular

A utilização de organismos vivos no âmbito da investigação científica levantou desde sempre questões de bioética e um crescente interesse ao longo dos tempos por métodos alternativos.59 _{Embora o conceito de métodos alternativos seja muito amplo e}

na sua maioria não sejam capazes de substituir totalmente o uso de animais, estes métodos devem ser aplicados sempre que possível para estudos prévios in vitro, justificando por exemplo, o recurso a cultura de células. Para além da questão bioética, o uso de cultura de células em estudos in vitro traz inúmeras vantagens, nomeadamente: a possibilidade de controlar parâmetros físico químicos (como o pH, e a temperatura) assim como parâmetros fisiológicos (como a concentração de nutrientes).

Em 1907, Ross Harrison surge como precursor da cultura de células animais,60

mas somente em meados do século passado se verificou o desenvolvimento padronizado de meios de cultura e técnicas de manuseamento. Neste aspeto, o meio de cultura é um fator muito importante e complexo no desenvolvimento de linhas celulares imortalizadas e na sua manutenção. Ou seja, quando as condições de cultura são as apropriadas, as células em cultura podem ser mantidas por tempo indeterminado e expressar as suas características fisiológicas e bioquímicas verificadas in vivo. Este facto impulsionou o uso de cultura de células em diversas áreas do conhecimento, entre as quais cabe referir a toxicologia.61, 62

Em testes de toxicidade in vitro, as culturas de células constituem um bom modelo para avaliar a citocompatibilidade de compostos com potencial interesse biomédico numa variedade de células, sendo as linhas celulares L929 (fibroblastos

derivados de tecido conectivo), 3T3 (fibroblastos derivados de tecido embrionário de ratinho, Mus musculus) ou V79 (fibroblastos derivados do pulmão de hamster, Cricetulus

griseus) das mais utilizadas nesta área63_{. As culturas de células são ainda utilizadas em}

grande escala na indústria farmacêutica, não só para testes de toxicidade, como também para o rastreamento de substâncias com atividade biológica que poderão constituir potenciais novos fármacos.60

1.6.2. Linha celular L929

A linha celular L929 foi estabelecida por W. R. Earle em 1940.64_{Com registo na}

American Type Culture Collection - ATCC© CRL-6364™, ela provém de uma linha celular obtida de tecido conectivo de Mus musculus (Figura 1.18). As células desta linha celular retêm várias propriedades fisiológicas observadas in vivo, constituindo assim, um modelo fiável e reprodutível dos fibroblastos de tecido conectivo. Embora as condições de cultura desempenhem um papel determinante na forma que as células assumem, esta linha celular apresenta tipicamente morfologia do tipo fibroblasto. Estas células são de fácil cultivo e curto tempo de duplicação (24 h). Crescem em monocamadas e aderentes a um substrato (vidro ou plástico tratado). Esta linha celular é amplamente utilizada em ensaios de citotoxicidade e de biocompatibilidade, sendo recomendada por várias entidades reguladoras.65

1.6.3. Avaliação da citotoxicidade em cultura de células

Em cultura de células, vários estudos podem ser realizados de modo a avaliar a toxicidade de uma determinada substância e o tipo de dano que esta causa. Um dos

parâmetros frequentemente avaliados é a viabilidade celular, podendo ser determinado através de técnicas muito diversificadas.66

Assim sendo, a escolha do ensaio de viabilidade celular deve ter em consideração, não só os parâmetros a avaliar, como também a sua compatibilidade com a linha celular, possibilidade de interferências e a necessidade de otimização do ensaio. A viabilidade celular pode ser avaliada através de diferentes aspetos relevantes para a biologia da célula, nomeadamente: integridade membranar ( por recurso a fluoróforos de exclusão, como o azul de tripano e o iodeto de propídeo); libertação da enzima LDH; atividade metabólica (por recurso ao MTT, resazurina ou consumo de ATP); proliferação celular (através da quantificação de proteína com sulforodamina B, e quantificação de DNA com sondas intercaladoras como o DAPI), entre outros.

1.6.3.1. Ensaio da Resazurina

O ensaio da resazurina tem sido extensivamente utilizado na avaliação da função metabólica em células viáveis, sendo a resazurina uma das substâncias mais citadas na literatura em ensaios de citotoxicidade e de viabilidade celular, rastreamento e desenvolvimento de fármacos.67

A resazurina é um indicador redox (E0 = + 380 mV, pH 7, 25 ºC) que na sua forma

oxidada permeia as biomembranas das células viáveis e não viáveis. Uma vez no citosol de células viáveis, a resazurina atua como um aceitador intermediário de eletrões na cadeia transportadora de eletrões sem interferir com o seu funcionamento, podendo ser reduzida pelo NADPH (E0 = + 320 mV), FADH (E0 = + 220 mV) FMNH (E0 = + 210 mV)

NADH (E0 = + 320 mV) assim como pelos citocromos bc1 e c (E0 = + 290 mV a + 80

mV). Ao aceitar eletrões, a forma oxidada não fluorescente passa à forma reduzida fluorescente, cujo comprimento de onda máximo de emissão é 590 nm (Figura 1.19). Esta reação redox pode ser acompanhada quer colorimétrica quer fluorometricamente, relacionando-se o número de células viáveis com a extensão da redução da resazurina. O fato da resazurina ser um reagente não tóxico e estável no meio de cultura, permite que este seja usado na monitorização contínua de células em cultura, contrariamente a outros métodos colorimétricos, como os que recorrem a sais de tetrazólio como MTT, XTT, WST-1.68

Figura 1.19 - Esquema representativo da redução da resazurina por células viáveis.

1.6.3.2. Ensaio da libertação da LDH

Um outro bioensaio que também se foca no metabolismo celular é o ensaio da libertação da enzima lactato desidrogenase (LDH, E.C. 1.1.1.27). A libertação desta enzima, no sobrenadante de células em cultura, deve-se a alterações da permeabilidade membranar - associada a necrose celular e apoptose tardia - sendo indicativa de citotoxicidade.69

A LDH é uma enzima glicolítica que catalisa a conversão de piruvato em lactato, em condições de anaerobiose usando como cofator o NADH (Figura 1.20). Encontra-se virtualmente em todas as células e embora predomine no tecido hepático, renal e muscular é uma enzima estável, constituindo assim um bom marcador para avaliar in

vitro danos irreversíveis a nível celular.70 _{Existem vários métodos que permitem a}

determinação da atividade da LDH em cultura de células. Os mais frequentemente utilizados baseiam-se em medições espectrofotométricas e utilizam uma reação acoplada, como por exemplo, o consumo de NADH.71

Figura 1.20 - Representação esquemática da conversão de piruvato em lactato pela enzima LDH no meio extracelular de uma célula que apresenta danos.