Considerando-se que, ao serem inalados, os bacilos de M.
tuberculosis são fagocitados por macrófagos alveolares e são capazes de
sobreviver no interior destas células, avaliou-se a capacidade dos compostos de atravessar a membrana celular dos macrófagos e exercer atividade bactericida em M. tuberculosis intracelulares. Para isto, foi utilizado o modelo de infecção de células THP-1, de linhagem humana proveniente de leucemia monocítica aguda, conforme descrito por Monahan e colaboradores (2001).
Células THP-1 foram cultivadas e mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e L-glutamina 2 mM (Gibco™, Life Technologies, EUA), em estufa úmida a 37°C contendo 5% de CO2. Para a realização do ensaio, as células foram incubadas por um período de 4 dias e, ao atingir a densidade de 1-2 x 106 células/mL, foram tratadas com PMA 20 nM (do inglês, phorbol 12-myristate-13-
acetate – acetato miristato de forbol) (Sigma, EUA). Este tratamento
teve como objetivo estimular a diferenciação dos monócitos em macrófagos e subsequente adesão das células ao plástico das placas de fundo plano. Logo após a adição do PMA, as células foram distribuídas em placas de 24 poços de fundo plano, em densidade de 1x106 células/poço, em volume de 1 mL. Após incubação por 24 horas a 37°C em estufa úmida contendo 5% de CO2, as células foram lavadas com 500 µL de PBS, o que permitiu a retirada das células não aderidas. A adesão celular foi verificada em microscópio invertido e as células aderidas foram incubadas em meio RPMI 1640 suplementado (soro bovino fetal 10%, L-glutamina 2 mM) por mais 24 horas.
Para a etapa de infecção, culturas de M. tuberculosis em fase exponencial tardia em meio líquido 7H9 (7 a 12 dias) foram centrifugadas a 2.500 x g por 15 minutos e o sedimento foi ressuspendido em meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal e L-glutamina 2 mM. A suspensão foi homogeneizada passando-a seringa e agulha (0.6mm x 25 mm ou 31G), para desfazer os grumos bacterianos. Na sequência, a suspensão foi adicionada às células THP-1 estimuladas, em uma multiplicidade de infecção (MOI, do inglês
multiplicity of infection) de 1:1 e incubadas a 37°C em estufa úmida
contendo 5% de CO2. Após um período de infecção de 4 horas, os bacilos que não foram fagocitados foram removidos com o sobrenadante, e a camada celular foi lavada com PBS e tratada com os
compostos diluídos em meio RPMI suplementado, em quintuplicata. Os compostos foram utilizados em concentrações entre 50µg/mL e 6,25 µg/mL, em diluições seriadas na proporção 1:2. As células foram incubadas por 1, 2, 3, 4 e 7 dias a 37°C em estufa úmida contendo 5% de CO2. Células infectadas tratadas com o veículo dos compostos (DMSO 1%) e INH (2µg/mL a 0,25 µg/mL, em diluições seriadas 1:2) foram utilizadas como controles dos experimentos. O experimento foi realizado em duplicata biológica.
Após o tratamento com os compostos, foram realizados dois procedimentos: avaliação da viabilidade das células THP-1 e contagem das UFC. Visto que o PMA é um agente que apresenta toxicidade para as células e que a infecção por M. tuberculosis também causa morte celular, é necessário verificar a toxicidade dos compostos neste modelo de infecção. Como mencionado anteriormente, o tratamento com os compostos foi realizado em quintuplicada. Uma duplicata foi utilizada para avaliar a viabilidade das células THP-1 e, a partir da triplicata, foi realizada a quantificação de UFC.
Para avaliação da viabilidade celular, utilizou-se o reagente CellTiter-Blue® (Promega, EUA), que baseia-se na capacidade de células metabolicamente ativas de reduzir o corante azul resazurina em resofurina, um produto fluorescente rosa. Após lavagem das células infectadas com 500 µL de PBS, adicionou-se às células provenientes da duplicata 500 µL de RPMI suplementado e 50 µL do reagente CellTiter- Blue (concentração final de 10%). A reação foi incubada por 3 horas a 37°C em estufa úmida contendo 5% de CO2 e o sinal fluorescente foi quantificado utilizando-se o leitor Glo-Max® Explorer Multimode Detection System.
As células provenientes da triplicata foram lavadas com 500 µL de PBS, para retirada de restos celulares e bactérias extracelulares. Na sequência, foram rompidas utilizando-se 500 µL de SDS 0,25% (do inglês, sodium dodecyl sulfate – dodecil sulfato de sódio) e seringa e agulha (0.6mm x 25 mm), para auxiliar o rompimento dos grumos bacterianos. A suspensão foi diluída em PBS 10-1 a 10-6 vezes e semeadas em meio 7H10 suplementado com OADC. As placas foram incubadas a 37°C por 28 dias e, após esse período, foi realizada a quantificação de UFC.
5.3.11 Avaliação da atividade antimicobacteriana em estrutura granuloma-like
Os compostos também foram testados em estrutura granuloma-
like, que tem como objetivo simular a principal estrutura formada
quando ocorre a infecção por M. tuberculosis. Para a obtenção das células, foram coletados 10 mL de sangue de dois doadores saudáveis em tubos contendo EDTA (ácido etilenodiamino tetracético). Os eritrócitos foram lisados utilizando-se solução tampão de cloreto de amônio 0,8%, em proporção 1:2, durante 10 minutos, com homogeneização constante. Após centrifugação a 1200 rpm por 10 minutos, o sedimento contendo os leucócitos foi ressuspendido em 1 mL de meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal. Após contagem em câmara de Neubauer, as células em concentração 6,0 x 105/mL foram distribuídas em placas de 96 poços de fundo plano, contendo agarose 1% dissolvida em meio RPMI. Após a distribuição, as células foram infectadas com M. tuberculosis H37Rv em solução contendo 6,0 x 106 bactérias/mL (MOI = 10). As placas foram incubadas a 37°C em estufa úmida contendo 5% de CO2 por três dias, para a formação do granuloma. No quarto dia, foram adicionados os compostos na concentração 20µM e 100µM, em triplicata. Como controle, foram utilizados poços contendo INH 100µM, DMSO 1% (veículo do composto), poços sem tratamento e poços sem infecção. Após incubação por 24 horas, o sobrenadante foi retirado e as células do granuloma foram lisadas com solução de saponina 1%. O lisado foi submetido a diluições seriadas em base 10 e semeado em meio 7H10 suplementado com 10% de OADC. Após 21 dias de incubação a 37°C, foi realizada a contagem de UFC/mL. A análise dos dados foi realizada utilizando-se o
software GraphPad Prism 5. Para a análise estatística, foi utilizada a
análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida pelo pós-teste de Bonferroni. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.