Bien que le BaLM semble être la plus simple des approches de super-résolution qui nous permettent d’apprécier l’organisation en clusters des molécules de LFA-1, les défis sont
Tableau 2 : Comparatif des tailles de clusters obtenues avec la technique du BaLM en regard de la microscopie confocale
nombreux pour réussir à réaliser une expérience BaLM remplissant toutes les conditions requises pour nos échantillons. Entre autres parmi les difficultés liées à cette approche, nous avons pu observer que LFA-1 de conformation fermée sans stimulation ICAM-1 ou TCR, était organisée en nano-clusters de quelques centaines de nanomètres de diamètre à la surface de cellules Jurkat non stimulées. Nous sommes parvenus à atteindre une résolution suffisante pour apprécier individuellement les nano-clusters de LFA-1 avec une résolution qui est trois fois meilleure comparée à la microscopie confocale. En revanche, plusieurs soucis non-négligeables restent à régler comme le mouvement axial lors des acquisitions, le temps d’acquisition et de reconstruction qui sont très longs et la génération de données très lourdes nécessitant des quantités importantes d’espace de stockage. Pour ces raisons nous avons abandonné l’extension de la technique en multicouleur et sommes passés à la mise en place d’autres approches plus adaptées.
La technique du dSTORM
Pour rappel, le dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) consiste à faire clignoter des molécules fluorescentes de manière stochastique (blinking), après les avoir fait passer dans un état de non fluorescence appelé état noir (dark state), grâce à un tampon particulier contenant un réducteur 24. En effet le dSTORM est basé sur les propriétés de clignotement de certaines sondes fluorescentes et leur capacité à photo-commuter réversiblement à partir d'un état de fluorescence (en rouge sur le schéma, F, Figure 21) avec un taux de transfert de photons kon vers un état noir stable (FH) avec un taux de transfert de photons koff (diagramme de Jablonski, Figure 21). Le transfert vers un état noir et le photo-clignotement sont contrôlés par la puissance du laser et la composition du tampon de montage de l’échantillon. Le passage à l'état noir nécessite un tampon avec une propriété redox. Il contient un réducteur appelé MEA pour ß-mercaptoéthylamine et des piégeurs d'oxygène - Glox (Glucose, glucose oxydase et catalase). Les avantages de cette technique sont: l'utilisation de
certaines sondes fluorescentes communes et le gain en résolution permettant d’obtenir des résolutions à l’échelle de la molécule unique. Comme l’approche du BaLM ne permettait pas d’atteindre une résolution satisfaisante pour distinguer des molécules individuelles, nous avons entrepris de développer l’approche du dSTORM afin d’établir la distribution de la molécule de
LFA-1 à la surface des lymphocytes T CD8+.
A. Stratégie expérimentale
Pour mieux visualiser les molécules de LFA-1 avec une résolution qui se rapproche de celle de la molécule unique, nous avons choisi de développer le dSTORM puisque la résolution latérale théorique est de 10 à 20nm et la précision de localisation est inférieure à 10nm. Pour commencer, nous avons appliqué cette approche sur des lignées cellulaires qui sont adhérentes au verre, les fibroblastes HFF. L’étalement des cellules permet de bien distinguer les cytosquelettes d’actine et de tubuline. Les filaments d’actine et les microtubules constituent des structures idéales pour estimer la résolution de notre approche de dSTORM car leurs tailles sont connues. L’épaisseur d’un filament d’actine est d’environ 7 à 10nm et celle d’un filament de microtubule est d’environ 25nm. Pour la mise en place de notre approche nous avons utilisé des
Jablonski diagram 1 F0 1 F1 3 F FH koff kon Kex
Figure 21: Diagramme de Jablonski représentant les états d’oscillation des molécules fluorescentes en dSTORM
lamelles en verre sur lesquelles des cellules HFF ont été déposées, nous les avons laissées s’étaler puis marquées avec l’anticorps anti-tubuline alpha afin de révéler les microtubules. Comme anticorps secondaire, nous avons utilisé un anti-IgG1 couplé à l’Alexa Fluor 647. Le choix de l’Alexa Fluor 647 est basé sur le nombre important du « duty cycle » 12. Le système
utilisé pour l’acquisition des images dSTORM est un Nikon TI-E muni d’un objectif 100x (oil immersion) inversé avec une ouverture numérique de 1.4. Les lasers intégrés vont de 405nm à 663nm. Le setup est équipé de deux caméras Evolve EMCCD et d’une caméra sCMOS. Pour cette approche nous avons utilisé une EMCCD qui permet de recueillir plus de photons par pixel grâce à une taille de pixel plus grande (16µm/pixel) et un meilleur rapport signal sur bruit. Pour réaliser nos expériences nous avons testé quatre tampons de montage différents: Vectashield-H1000, MEA-glox-catalase, NPG-DABCO et GSSH. Nous nous sommes finalement rendu compte comme expliqué dans les travaux de Dempsey (Tableau 3) que le MEA-glox-catalase était le tampon le plus adapté pour la mise en place de notre approche. Les images ont ensuite été reconstruites avec le module WaveTracer194 et analysées par les
softwares MetaMorph et QuickPALM d’ImageJ pour une comparaison.
Tableau 3: Caractéristiques des fluorophores excitables dans le rouge lointain. (Dempsey et al.2011)12
Pour la mise en place de l’approche du dSTORM nous avons donc utilisé des fibroblastes HFF sur lesquels nous avons marqué avec des anticorps l’alpha-tubuline pour révéler les microtubules. Les HFF sont des cellules qui adhèrent à la lamelle directement. Sur la figure ci- dessous les panels du haut représentent l’image des microtubules en microscopie de champ large et les panels du bas l’image de microscopie de dSTORM. Sur l’image de microscopie de champ large en vert (image diffractée) on peut constater à travers le zoom fait dans une région d’intérêt peu dense en microtubules que les structures sont floues. Par contre sur l’image dSTORM en rouge feu (panel du bas, Figure 22) les structures sont plus fines et apparaissent nettement. Pour cette acquisition un nombre de 20 000 images a été acquis et la reconstruction a été faite avec une taille de pixel de 10nm. En faisant un zoom dans la même région d’intérêt que dans l’image diffractée, on arrive à distinguer les filaments de tubulines et surtout là où ils apparaissaient comme un seul filament on dénombre plusieurs filaments les uns à côté des autres. En traçant une ligne sur une région correspondant à la même structure dans les deux images, on se rend compte que la largeur à mi-hauteur dans l’image dSTORM (graphique du bas, Figure 22) est huit fois plus petite que la largeur à mi-hauteur dans l’image de microscopie de champ large. Cette observation signifie que l’épaisseur des microtubules sur l’image dSTORM est d’environ 50nm comparé à 400nm en microscopie de champ large. Sachant que l’étude des microtubules a révélé que les filaments mesurent 25 nm d’épaisseur195, notre résultat
et secondaires dont l’encombrement stérique augmente l’épaisseur apparente des microtubules.
Par la suite, nous avons appliqué l’approche du dSTORM aux lymphocytes T CD8+ primaires
pour étudier l’organisation des clusters de LFA-1 à leur surface suite à un étalement sur un coating combinant ICAM-1 et anti-CD3 pour induire la formation de la synapse. Les expériences ont été menées dans les conditions où seule la conformation de LFA-1 a été marquée avec HI111 en anticorps primaires et révélée par un anticorps secondaire anti-IgG1 couplé à l’Alexa Fluor 647. Les lamelles ont été montées dans un tampon ne contenant que du MEA car parmi tous les tampons testés c’est celui qui a montré un blinking et un passage à l’état noir optimum. A partir de ce point, toutes les acquisitions dSTORM ont été réalisées avec du MEA seul. Un nombre de 20 000 images a été acquis. La reconstruction a été faite avec une taille de pixel de 10nm. Les résultats ont permis d’établir la topologie des clusters de LFA-1
Figure 22 Visualisation de l’α-tubuline dans des lignées cellulaires HFF. (A-B) Image de fluorescence en Wild field du réseau de microtubule (anticorps anti-alpha-tubuline) marqué à l’Alexa Fluor 647 dans les HFF, étalées sur une lamelle de verre. Barre d’échelle=5µm. (D-F) Image dSTORM du réseau montré dans les panels A-B. Taille de pixel=10nm. (E) Plot profile sur un filament de microtubule montré dans le panel (A). FWHM=400nm. (F) plot profile sur un filament de microtubule montré dans le panel (C). FWHM=50nm.
fermée et de déterminer leur taille et leur nombre. Les panels du haut de la figure ci-dessous (Figure 23) représentent une image diffractée prise en microscopie de champ large d’une cellule étalée de façon radiale formant la synapse immunologique (Figure 23A-C). En révélant la conformation fermée de la molécule de LFA-1, on note une distribution avec une intensité du signal plus forte à la périphérie de la cellule et moyennement faible vers l’intérieur de la cellule (Figure 23A). Des zooms sur des régions d’intérêt nous permettent de nous rendre compte qu’avec la microscopie de champ large on n’est pas capable de distinguer les clusters de LFA- 1 du fait de la diffraction (Figure 23B-C). En effet nous ne distinguons qu’une grande et très intense structure diffractée. En revanche sur les panels du bas (Figure 23D-F) on distingue une distribution de petites structures à la surface de la cellule avec un regroupement plus intense formant une sorte de ligne peu épaisse à la périphérie de la cellule (Figure 23D). Le zoom intermédiaire (Figure 23E) nous permet de distinguer des structures ponctiformes. Par contre le zoom le plus grand (Figure 23F) nous permet de distinguer des clusters de molécules, ce qui nous porte à dire que le dSTORM que nous avons mis en place est suffisamment résolu pour nous permettre d’apprécier la taille des clusters de LFA-1. Le panel G nous permet de discriminer les clusters de LFA-1 selon un code couleur correspond à des tailles données en nm² (la surface des clusters). Nous sommes capables de distinguer des tailles allant du magenta (environs 120000 nm²) à la périphérie cellulaire jusqu’au bleu (supérieur à 100 nm²) au centre de la cellule.
B. Conclusion et limites
L’approche du dSTORM que nous avons mise en place nous permet d’atteindre des résolutions qui sont 8 fois meilleures que la microscopie de champ large comme mesurées précédemment sur les images dSTORM de la tubuline. De plus, elle permet d’apprécier les nano-clusters de LFA-1 à la surface des lymphocytes T primaires. Toutefois, il nous manque des outils dédiés à l’analyse des clusters moléculaires dans notre expérience pour mieux apprécier et définir la présence de clusters de LFA-1.
De plus, dans notre acquisition nous avons utilisé une illumination en champ large ce qui veut dire que le bruit de fond diffusé est très important. En d'autres termes, le signal que nous récupérons provient de plusieurs plans de notre cellule. Par ailleurs des artéfacts liés à la densité
Figure 23 : Topologie de LFA-1 de conformation fermée à la synapse de lymphocytes T primaires humains. (A-C) Image de champ large de LFA-1 marquée avec l’anticorps HI111 révélée avec l’Alexa Fluor 647. Les cellules ont été étalées sur une lamelle imprégnée d’ICAM-1 et d’anti-CD3. Barre d’échelle=5µm. (D-F) Image dSTORM de la cellule montrée dans les panels A-C. Taille de pixel=10nm. Distribution des clusters de LFA-1 avec un code couleur de surface en accord avec l’échelle représentée (G).
des marquages, à la perméabilisation ou à la fixation sont possibles196. Il faut donc être vigilant
à la préparation des échantillons comme à l’acquisition et à la reconstruction.
La technique du PALM
Ainsi que nous l’avons rappelé en introduction, la localisation et l’efficacité d’activation de la molécule de LFA-1 est en étroite relation avec le cytosquelette d’actine178. Nous avons
donc cherché à comprendre comment ces deux structures pouvaient interagir au niveau de la synapse immunologique. Pour ce faire, nous avons souhaité développer l’approche du PALM pour visualiser les filaments d’actine en combinaison du dSTORM afin de visualiser les molécules de LFA-1.
Le PALM (PhotoActivable Localization Microscopy) consiste à faire exprimer une protéine fluorescente capable d’être photoconvertie d’une longueur d’onde à une autre par photo- conversion de manière stochastique5. Dans notre étude nous avons utilisé une protéine
photoconvertible appelée la Dendra-2 dérivée de la GFP197. Cette protéine habituellement
excitée à la même longueur d’onde que la GFP, est capable de passer d’une émission de fluorescence dans le vert à une émission dans le rouge. Le passage d’un état à un autre nécessite l’utilisation d’un laser d’activation 405 par une faible illumination. Le laser d’activation induit des modifications chimiques qui sont responsables des variations spectrales198
A. Stratégie expérimentale
Afin d’obtenir une description encore plus fine du cytosquelette d’actine nous souhaitons faire exprimer une protéine fluorescente la Dendra-2, fusionnée avec un peptide capable de se lier à l’actine : Lifeact200 qui est couramment utilisé pour la visualisation de l’actine. L’expression
d’une protéine fluorescente plutôt que l’emploi des anticorps nous permet d’être plus précis notamment dans la quantification des molécules uniques. La protéine photoconvertible dendra- 2 émet dans le vert (507nm) avant la photoconversion puis dans le rouge (573 nm) après la photoconversion.
Après amplification et purification du plasmide contenant la fusion Dendra-2 / Lifeact, nous avons procédé à la transfection de fibroblastes HFF avec de la lipofectamine comme agent transfectant. Peu de cellules ont été transfectées. Nous avons, ensuite, décidé d’appliquer la transfection sur des lymphocytes T CD8+ primaires fraîchement purifiés du sang de donneurs
sains. Le plasmide a été introduit dans ces cellules par électroporation, en utilisant le nucléofecteur AMAXA. Cette dernière étape nous a permis de réaliser des expériences de migration des lymphocytes T en réponse à un gradient de chimiokine afin d’étudier le remodelage du cytosquelette d’actine, la vitesse de migration et la morphologie cellulaire. Ces expériences ont fait l’objet d’une revue dans Frontiers137 jointe en annexe. Par la suite nous
avons dû comparer le produit de fixation adéquat pour nos cellules. Dans notre étude nous avons opté pour le paraformaldéhyde à 4%. Le milieu de montage utilisé est le même que celui du dSTORM. Pour notre étude nous avons voulu dans un premier temps mettre en place le PALM sur notre plateforme en utilisant le même système d’imagerie que celui utilisé pour le dSTORM. L’illumination de l’échantillon avec le laser 488 nm excite la Dendra-2 dans le vert, l’ajout du laser d’activation 405 nm induit une photoconversion. Simultanément l’illumination de la même protéine avec le laser 561 nm entraîne une émission dans le rouge. Malheureusement les
lasers que nous possédons ne sont pas assez puissants pour réaliser la photoconversion des molécules de manière stochastique.
B. Conclusion et limites
L’équipement que nous possédons manque de puissance au niveau du laser 561 nm, pour réaliser correctement la photoconversion stochastique. Un temps d’optimisation plus long que prévu est nécessaire. En conséquence, cette méthode ne sera pas optimisée pendant les trois années de thèse.
dSTORM multicouleur
Ensuite nous nous sommes demandés s’il ne serait pas plus intéressant d’étendre le dSTORM en deux ou trois couleurs pour mieux répondre aux questions suivantes :
- la distribution de la molécule de LFA-1 à la synapse immunologique, - l’organisation de cette molécule en lien avec l’architecture du cytosquelette
d’actine
- la distribution des molécules de LFA-1 selon leur conformation fermée ou activée à la synapse.
Dans un premier temps nous avons souhaité visualiser l’organisation des différentes conformations de LFA-1 à la surface des lymphocytes T en lien avec le cytosquelette d’actine. Nous avons envisagé la mise en place du dSTORM deux couleurs afin de pouvoir étudier avec précision les molécules de LFA-1 dans les cellules normales et dans les cellules déficientes en WASP provenant de patients WAS. Nous avons commencé par le dSTORM deux couleurs pour l’étude de l’organisation de la conformation fermée et activée de LFA-1, l’objectif étant de visualiser avec précision la localisation et la distribution des molécules en fonction de leurs conformations.
En parallèle de la combinaison du dSTORM avec le PALM, nous avons profité de l’installation d’un système d’acquisition ELYRA-PS (Zeiss) sur la plateforme d’imagerie du site de Rangueil (partenaire de notre plateforme) pour mettre en place une approche dSTORM deux couleurs. Ce système est dédié et construit pour la super-résolution. Par conséquent la puissance des lasers est plus élevée et adéquate pour une utilisation dans les approches de super-résolution comme le dSTORM et le PALM. Théoriquement, il est possible de mettre en place une approche dSTORM multicouleur avec ce nouvel équipement. Cependant, il faut employer une seule et même solution tampon qui permette la permutation entre l’état noir et l’état de fluorescence pour les différentes molécules de fluorescence utilisées. Nous avons d’abord commencé avec le tampon utilisé pour le dSTORM une couleur en gardant les mêmes concentrations et le même pH.
Dans notre étude nous avons utilisé, comme modèle cellulaire, des lymphocytes T CD8+ étalés
sur des lamelles imprégnées d’ICAM-1 et d’anticorps anti-CD3 pour former la synapse immunologique. Pour révéler la conformation fermée de LFA-1 nous avons utilisé l’anticorps HI111 couplé à l’Alexa Fluor 488 (en vert) et l’anticorps A24 couplé à l’Alexa Fluor 647 (en rouge) pour révéler la conformation de haute affinité. Sur la Figure 25, le schéma illustre les différents sites de liaison des anticorps employés au cours dans ce projet. L’anticorps HI111 se lie au L domaine empêchant l’ouverture de la molécule (en violet). L’anticorps A24 se lie au I domaine , accessible seulement sous la conformation ouverte de la molécule (m24 en vert). L’anticorps TS2/4 permet de révéler toutes les conformations de LFA-1 et Kim127 (qui ne sera
jamais utilisé dans ce projet) permet de révéler les conformations d’affinité intermédiaire et de haute affinité.
Dans la Figure 26, le panel du haut représente un lymphocyte T CD8+ provenant d’un donneur
normal. 20 000 images ont été acquises et la taille des pixels des images reconstruites est de 20 nm. Le premier cadran en haut à gauche représente une image en transmission de la cellule sur laquelle on peut voir la cellule étalée avec un lamellipode autour de ce qui représente le noyau. En premier lieu, on note que la distribution de LFA-1 des deux conformations en nano-clusters forme un anneau à la surface de la synapse. En zoomant sur l’image de superposition des deux conformations, on s’aperçoit que les nano-clusters de LFA-1 de conformation fermée (vert) se distinguent des nano-clusters de LFA-1 de haute-affinité (rouge). Nous observons au voisinage des clusters rapprochés, une zone de recouvrement partiel (apparaissant en jaune). En outre, il est intéressant de noter que dans le cas des lymphocytes T CD8+ de patients WAS, la cellule
n’est pas entourée par une structure de type lamellipode et LFA-1 est organisée en nano-clusters mais ces nano-clusters ne sont pas regroupés en anneau. De plus les bords de la cellule sont marqués par des regroupements de nano-clusters moléculaires formant des bords francs. Enfin
Figure 25:Schéma représentant les sites de liaisons des anticorps utilisés pour notre étude (Comrie et al.2015)178
mAb HI111
les nano-clusters des différentes conformations sont bien séparés. On observe soit du vert soit du rouge mais avec très peu de zones de contact. Nous pouvons donc en déduire que les nano- clusters de LFA-1 fermée sont distincts des nano-clusters de LFA-1 de haute-affinité.
Figure 26 : Distribution de LFA-1 dans les lymphocytes T primaires de donneurs normaux et de patients WAS. Image de la distribution de LFA-1 non-activée et activée en double dSTORM. Taille de pixel=20nm
A. Conclusion et limites
LFA-1 s’organise en clusters formant un anneau (ceinture) à l’échelle cellulaire et les conformations fermée et ouverte constituent des clusters distincts. Toutefois, avec le
dSTORM deux couleurs, nous notons des trainées (en forme de comète) qui nous laisseraient penser que nos images dSTORM avec le fluorophore Alexa Fluor 488 ne sont pas optimales et que notre fluorophore photoblanchit après acquisition de l’Alexa Fluor 647.