41 3.2.3 La validation des modèles
3.2.5 Conclusion partielle
químicos
O conceito de design de fármacos baseado em fragmentos químicos (FBDD) surgiu com os trabalhos de Jenks70 e Ariens71, que
propuseram que um fármaco poderia ser dividido em várias subestruturas moleculares, chamadas de epítopos ou fragmentos, que ligam a diferentes regiões do local de ligação, próximas entre si, e que a energia livre de ligação do fármaco seria resultado da soma das energias livres de cada epítopo. A primeira aplicação deste conceito no design de ligandos foi feita por Fesik e seus colaboradores72, numa
abordagem usando SAR por NMR. Após cerca de 15 anos, surge o primeiro fármaco aprovado pela FDA, desenvolvido através de FBDD – o vemurafenib, vendido sob o nome comercial de Zelboraf – um agente quimioterapêutico contra melanoma expressando o gene BRAF mutado73, 74. A aprovação deste fármaco constitui um marco crucial
para a afirmação da potencialidade do FBDD.
Limitações da abordagem convencional e espaço
químico de fragmentos
Na abordagem convencional ao design de fármacos, são testadas moléculas que, geralmente possuem características muito próximas de fármacos, algumas descritas pelas regras de Lipinski. Embora o teste deste tipo de moléculas com características de fármacos possa ser visto como vantajoso, na medida em que há maior probabilidade de estas
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serem capazes de chegar aos alvos terapêuticos, o espaço químico de moléculas com massa molecular abaixo de 500 é cerca de 1060, valor
este que é muito difícil de amostrar, mesmo utilizando ensaios de HTS que conseguem testar milhares de compostos contra um determinado recetor75-77.
Outra limitação é o aumento da massa molecular (em cerca de 80) e lipofilicidade (aproximadamente 1 unidade logarítmica), resultante da adição de grupos químicos durante a otimização de moléculas com afinidade elevada para o alvo nos ensaios HTS78. Estes aumentos
resultam na perda de características de fármaco pelo ligando, reduzindo a probabilidade de este ser uma molécula biologicamente ativa79.
Estas limitações, associadas à abordagem que envolve moléculas com características de fármacos, não existem numa abordagem FBDD. Numa campanha deste tipo são usadas bibliotecas de moléculas de pequenas dimensões, geralmente com massa molecular próxima de 250 e pouco funcionalizadas. Existem vários critérios para a construção de tais bibliotecas, sendo o conjunto de critérios mais comum a “Regra dos três”80. Este conjunto de critérios foi proposto por Congreve e Carr,
após uma análise de um conjunto variado de fragmentos com boas propriedades contra uma panóplia de alvos, e diz que um fragmento deve ter massa molecular não superior a 300, um número de dadores ou aceitadores de ligações de hidrogénio igual ou inferior a 3 e ClogP igual ou inferior a 3. Outros critérios que podem ser adicionados incluem o número de ligações que podem rodar não superior a 3 e superfície polar acessível não superior a 60.
A vantagem principal da abordagem baseada em fragmentos em relação às estratégias convencionais, é que o espaço químico de fragmentos com massa molecular não superior a 300 (~108) é bastante
menor, o que faz com seja mais fácil amostrar o espaço químico de fragmentos do que de moléculas com tamanho não superior a 50075-77.
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Energia livre de ligação versus eficiência do ligando
No design de fármacos seguindo a abordagem clássica, a afinidade, que pode ser medida em termos de energia livre de ligação, é o fator mais importante na seleção dos melhores ligandos. No entanto, existe correlação entre a afinidade e a massa molecular, o que faz com que moléculas que tenham boas afinidades nos ensaios de HTS sejam demasiado grandes, violando mais do que uma regra de Lipinski.
A eficiência do ligando (LE), uma medida proposta por Hopkins e seus colaboradores81, permite contornar o enviesamento da afinidade
para compostos maiores, ao contabilizar o contributo de cada átomo diferente de hidrogénio (cujo número é definido por HAC) para o total da energia livre de ligação. Esta medida é obtida da seguinte forma:
a partir da afinidade de ligação (Kd) dada pelos ensaios pode se
obter a energia livre de ligação
a energia livre por átomo diferente de hidrogénio obtém-se a partir de
Apesar de os ligandos selecionados através de um ensaio de HTS terem afinidades de ligação relativamente elevadas (Kd na ordem dos
100-1µM), em grande parte dos casos a LE é baixa79. Uma explicação
para este facto está descrita na Figura 2, que descreve, de uma forma simplificada, um ligando com afinidade relativamente elevada mas cuja ligação ao alvo é pouco específica, ou seja, pouco eficiente.
A LE é especialmente importante na abordagem FBDD. Como os fragmentos são pequenos e pouco funcionalizados, as afinidades destes são muito mais baixas do que as de ligandos testados em ensaios HTS82.
A LE pode assim ser usada como guia para a adição de funcionalizações e otimização do fragmento, pois permite uma mais
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fácil racionalização da contribuição energética dos grupos químicos utilizados.
Embora a medida de LE seja um conceito bastante importante descoberta de novos fármacos, há uma clara tendência, transversal a todos os alvos, que indica que a LE diminui com o aumento do número de HAC. Esta tendência foi observada por Reynolds et al.83, num estudo
à biblioteca BindingDB84, uma base de dados contendo informação
sobre as constantes de afinidade de uma grande variedade de complexos ligando-alvo. Deste modo, torna-se difícil interpretar o valor de LE e compará-lo entre ligandos ou fragmentos de diferentes tamanhos, sendo este problema bastante evidente, devido ao crescimento dos fragmentos iniciais em candidatos com características de fármacos.
A medida que Reynolds e seu grupo propõem no mesmo estudo83, é
uma que incorpora o tamanho do ligando, em termos de número de HA, na medida de LE. Através do ajuste de uma função exponencial
Figura 2. Representação esquemática de um ligando com características de
fármaco com afinidade relativamente elevada para o alvo, mas com baixa LE. A afinidade deste tipo de moléculas deriva da superfície molecular em contacto com o recetor, sem que se formem interações de elevada eficiência com as regiões chave do local de ligação. Este tipo de moléculas, na ausência de informação estrutural (num estudo de SAR, por exemplo), torna-se muito difícil de otimizar. As Figuras 4 e 5 mostram o exemplo contrário, numa abordagem baseada em fragmentos químicos.
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ão aos maiores valores LE para cada valor de HAC, presentes na BindingDB, foi criado um fator de escala, ao qual chamou de LEScale, sendo este
descrito pela seguinte equação:
( )
A medida proposta chama-se fit quality (FQ) e é definida pela equação:
,
sendo esta medida faz com que os melhores ligandos tenham um valor de FQ próximo de 1, independentemente do tamanho.
Do fragmento ao candidato
Devido às baixas afinidades associadas aos fragmentos, a identificação destes no local de ligação do alvo é geralmente feita através de métodos biofísicos, como cristalografia de raios-X, NMR, SPR, entre outros, sendo que ensaios de HTS não são eficientes, nesta abordagem, devido aos seus baixos limites de deteção 85. Destas
metodologias, a cristalografia de raios-X e, em alguns casos, o NMR são as mais aconselhadas, principalmente devido à informação sobre o modo de ligação ao alvo que pode ser obtida a partir destes métodos.
Após identificação dos fragmentos iniciais, é necessário “crescer” os fragmentos, de forma a aumentar a especificidade – que é reduzida nos fragmentos devido à baixa funcionalização destes – e a potência. Existem várias estratégias para transformar fragmentos iniciais em candidatos, sendo as mais importantes a evolução de fragmentos e a ligação de fragmentos.
Evolução de fragmentos. Este tipo de estratégia segue o conceito de adição de grupos para criar interações com outras regiões do local de ligação alvo, e consequentemente aumentar a potência, conceito este, bastante utilizado na abordagem convencional ao design de novos fármacos79, 85. Esta estratégia é a mais popular e efetiva em FBDD.
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design com base na estrutura do alvo é utilizada86. Caso contrário, são
testados análogos dos fragmentos iniciais de forma a aplicar uma abordagem SAR85.
Uma abordagem ao desenvolvimento de fragmentos, similar à evolução, é a otimização de fragmentos. Nesta abordagem, tal como na evolução de fragmentos, é feita a adição de grupos funcionais ao fragmento. No entanto, ao passo que na evolução o objetivo é aumentar a potência do fragmento, na otimização o objetivo é melhorar as propriedades, como a solubilidade ou permeabilidade. Um esquema do processo está representado na Figura 3
Ligação de fragmentos. Estra estratégia envolve a ligação de dois fragmentos que se ligam em regiões diferentes, mas próximas, do local de ligação alvo, usando um “ligador” molecular, ou linker. Este linker pode ser flexível ou rígido. Esta técnica tornou-se de certa forma sinónimo de design de fármacos com base em fragmentos, em muito devido ao facto que o primeiro trabalho de aplicação da abordagem FBDD, o trabalho “SAR by NMR” referido anteriormente72, utiliza a
estratégia de ligação de fragmentos para desenvolver inibidores para a
Figura 3. Representação esquemática da estratégia de evolução de
fragmentos. a) o fragmento 1 liga-se uma região chave do local de ligação alvo; b) o fragmento 1 é evoluído através da adição de grupos substituintes de forma a estabelecer interações favoráveis com a superfície superior e a segunda região chave do local de ligação.
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FK506 binding protein. Na Figura 4 está representado um esquema que descreve a estratégia de ligação de fragmentos.
Quando a ligação de dois fragmentos é feita da forma ideal, ocorre um efeito de cooperatividade positiva, semelhante ao efeito referido no capítulo das interações intermoleculares, e referido como efeito de superaditividade. Isto significa que a soma das energias livres de ligação de cada fragmento separado será menos negativa que a energia livre de ligação do ligando resultante da ligação desses dois fragmentos entre si. A equação que descreve este efeito foi proposta por Jencks70:
em que ΔGA e ΔGB são as energias livres de fragmentos A e B, e ΔGs
é a energia livre da ligação, que pode ser vista como o termo de superaditividade. Este termo pode ser decomposto em vário termos energéticos que têm em conta as alterações entrópicas na rotação e translação, e as perdas na energia livre de ligação, associadas a alterações na conformação de ligação dos fragmentos A e B, que poderão ter ocorrido pela introdução do linker. Assumindo o caso ideal, em que não há alterações nas conformações de ligação de A e B, podemos assumir que o termo de superaditividade é definido pelas alterações na entropia de rotação e translação87.
A constante de dissociação KDAB para dois fragmentos A e B ligados
entre si pode ser descrita como
,
Figura 4. Representação esquemática da estratégia de ligação de
fragmentos. a) o fragmento 1 liga-se na primeira região chave do local de ligação; b) o fragmento 2 liga-se numa segunda região chave, adjacente à região 1; c) os 2 fragmentos são ligados entre si através de um linker, sem que a conformação dos fragmentos 1 e 2 seja alterada.
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em que KDA e KDB são as constantes de dissociação de A e B,
respetivamente, e E é um coeficiente de ligação, também descrito na literatura como fator teórico do linker de fragmentos, fL 88. Este
coeficiente constitui uma medida útil da eficiência da ligação de dois fragmentos, e está relacionado com a equação de ligação de fragmentos, proposta por Jencks da seguinte forma:
Coeficientes de ligação abaixo de um significam que existe um efeito de cooperatividade positiva, enquanto um coeficiente de ligação acima de 1 significa que existe um efeito de cooperatividade negativa, isto é, que a soma das energias livres dos fragmentos A e B é maior que a energia livre do composto resultante da ligação dos dois.
A principal limitação desta estratégia está na escolha do linker. Um
linker rígido poderá induzir alterações na ligação dos fragmentos
ligados, ao passo que um linker flexível levará provavelmente a uma penalização do ponto de vista entrópico.
Metodologias computacionais em FBDD
Como já foi referido, a natureza intrínseca dos fragmentos químicos usados em FBDD faz com que os testes contra os alvos terapêuticos tenham de ser feitos através de metodologias biofísicas, como a cristalografia de raios-X ou o NMR. Apesar de estas metodologias permitirem ao químico medicinal conhecer a estrutura dos complexos fragmento-alvo, os custos, morosidade e débito destas são fatores desfavoráveis para uma abordagem unicamente experimental à estratégia de FBDD. Outra desvantagem está no facto de nem todos os alvos serem cristalizáveis, ou possíveis de estudar usando NMR.
Uma forma de contornar estas desvantagens da aplicação experimental do FBDD, é recorrer a métodos computacionais. O
docking, bastante utilizado em campanhas de design de fármacos com
base na estrutura do alvo66, também já foi aplicado com sucesso na
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ão terapêuticos, como a trombina89, fator Xa90 e cinase dependente de
ciclinas 4 (CDK4)91. No entanto a construção de bibliotecas de
fragmentos e a aplicação do docking em FBDD são complexas e ainda há progressos a fazer nesta área.
Uma das dificuldades está no facto de algumas funções terem sido parametrizadas de acordo com bibliotecas de ligandos com características de fármacos. Alguns estudos recentes, no entanto, apontam para que não existam diferenças significativas no desempenho das metodologias de docking, quer para moléculas com características de fármacos, quer para fragmentos químicos77, 92. Chen
e Soichet77 publicaram um estudo em que encontraram 10 fragmentos
com elevada afinidade (no contexto dos fragmentos) para a β- lactamase CTX-M, a partir de 69 fragmentos testados por docking. As estruturas de cristalografia de raios-X subsequentes, resolvidas por estes autores, mostraram que as conformações de ligação previstas correspondiam ao obtido experimentalmente. Estudos como estes são fortes evidências de que a aplicação de metodologias computacionais em FBDD é uma mais-valia. No entanto não existe nenhum estudo sistemático, isto é, sobre um conjunto variado de alvos, que confirme estas evidências, o que é importante dada a heterogeneidade de locais de ligação alvos com potencial terapêutico.
Este estudo teórico vem preencher essa ausência de um estudo sistemático. Neste trabalho, através do docking de uma biblioteca de 5930 fragmentos – criada com base em grupos químicos frequentes em fármacos comercializados – contra um conjunto variado de 35 alvos, respondemos a três questões chave para o FBDD: 1) até que ponto é, a biblioteca de fragmentos criada, capaz de amostrar as regiões chave do local ativo dos alvos? 2) Será, a metodologia de docking usada, capaz de reproduzir de forma precisa a conformação de ligação dos epítopos dos ligandos experimentais? 3)Qual o grau de promiscuidade de cada fragmento contra cada elemento do conjunto de alvos?
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