Conclusion

Dans cette étude, nous avons essayé de comprendre par l’utilisation de différentes méthodes comment deux lignées cellulaires d’origine épithéliale assez proche (les cellules Vero et les cellules HEK293) pouvaient présenter des différences de réponse cellulaire concernant la dépendance de la voie Ras/MAPK vis-à-vis de la PI3K. Nous avons montré que les différences observées sont liées au mode de recrutement du module Gab1/SHP2 auprès du récepteur, selon l’intensité du signal. Lorsque beaucoup de molécules d’EGFR sont mobilisées ou lors de stimulation de forte intensité, le module Gab1/SHP2 est recruté par l’intermédiaire de la protéine adaptatrice Grb2. Cependant, lorsque peu de molécules d’EGFR sont mobilisées ou lors de stimulation de faible intensité, le module Gab1/SHP2 est recruté grâce au domaine PH de Gab1, ayant une affinité pour les produits de PI3K, permettant ainsi l’activation efficace des MAPK, rendant alors l’activation de la voie Ras/MAPK dépendante de la PI3K.

PIP3 Forte stimulation Faible stimulation ou activité résiduelle PIP3 Forte stimulation Faible stimulation ou activité résiduelle

Figure 32: Schéma illustrant le rôle conditionnel de PI3K dans l’activation de la voie Ras/MAPK en fonction du mode de recrutement du module Gab1/SHP2 (Sampaio et al., 2008).

De plus, dans ces deux lignées cellulaires, par différentes approches, nous avons réussi à créer une dépendance ou non de l’activation de la voie Ras/MAPK vis-à-vis de la PI3K. Ainsi, en diminuant l’expression de Grb2 ou en inhibant l’activité de l’EGFR dans les cellules HEK293, l’activation de la voie Ras/MAPK devient dépendante de la PI3K, par conséquent le recrutement du module Gab1/SHP2 se fait par son domaine PH. Au contraire, lorsque le récepteur de l’EGF est surexprimé dans les cellules Vero, l’activation de la voie Ras/MAPK ne dépend plus de la PI3K lors

de stimulation de forte intensité, par conséquent le recrutement du module Gab1/SHP2 se fait par l’intermédiaire de la protéine Grb2.

Nous avons démontré par conséquent que le module Gab1/SHP2 intervient dans l’activation de la voie Ras/MAPK lors de stimulation de faible et de forte intensité, mais la seule différence observée provient du mode de recrutement du module Gab1/SHP2. Nous avons également montré que le module Gab1/SHP2 n’est pas redondant avec la voie canonique faisant intervenir le module Grb2/Sos.

Dans la dernière partie de ce travail, les résultats obtenus avec les lignées de glioblastomes suggèrent que le mécanisme de recrutement de Gab1 par son domaine PH est également utilisé dans des cellules tumorales présentant des résistances aux inhibiteurs de l’EGFR afin d’activer efficacement la voie des MAPK.

Nous avons montré que l’activation de la voie MAPK est indépendante de la PI3K dans une lignée de glioblastome surexprimant l’EGFR (U251-MG). Lorsque cette lignée est traitée par un inhibiteur de l’EGFR, la phosphorylation de l’EGFR est bien diminuée mais la voie des MAPK est activée. Ces cellules acquièrent donc une résistance aux inhibiteurs de l’EGFR. Lorsque ces cellules ont été traitées à la fois par des inhibiteurs de la PI3K et des inhibiteurs de l’EGFR, la voie des MAPK ainsi que le recrutement du module Gab1/SHP2 ont été inhibés. De tels effets ne sont pas observés lorsque les inhibiteurs sont utilisés séparément.

Par conséquent, nous pouvons donc dire que l’activation résiduelle de l’EGFR semble être suffisante pour favoriser l’activation de la voie des MAPK. Ce qui suggère donc que lors de l’inhibition de l’EGFR, les cellules tumorales résistantes aux inhibiteurs de l’EGFR mettent en place un mécanisme de recrutement du module Gab1/SHP2 dépendant de la PI3K. En effet, la diminution de la phosphorylation de l’EGFR due aux inhibiteurs de l’EGFR va restreindre le recrutement de Gab1 auprès du récepteur par l’intermédiaire de Grb2. Par conséquent, le recrutement de Gab1 va se faire par son domaine PH, domaine d’interaction avec le PIP3. Le recrutement de Gab1/SHP2 et l’activation de la voie des MAPK deviennent alors tout les deux dépendants de la PI3K. On se retrouve alors dans des conditions de faible stimulation. Dans ce cas précis, les inhibiteurs de la PI3K combinés aux inhibiteurs de l’EGFR vont permettre d’inhiber efficacement l’activation de la voie des MAPK.

PERSPECTIVES

Lors de notre étude, nous avons donc réussi à déterminer le mécanisme expliquant la dépendance de la voie Ras/MAPK vis-à-vis de la PI3K, impliquant le module Gab1/SHP-2. En effet, la dépendance de la voie Ras/MAPK vis-à-vis de la PI3K est conditionnée par le mode de recrutement du module Gab1/SHP2.

Des données cliniques de la littérature ont montré qu’une grande proportion de tumeurs sont résistantes aux inhibiteurs de l’EGFR (exemple : gefitinib) (Rubin BP et al Lab Invest 2006). D’après les résultats que nous avons obtenus avec une lignée cellulaire de glioblastomes (U251MG), nous pouvons penser que les cellules cancéreuses résistantes aux inhibiteurs de l’EGFR mettent en place une dépendance de la voie MAPK vis-à-vis de la PI3K par le mode de recrutement de Gab1/SHP2, ce qui pourrait expliquer que l’effet synergique observé lors de l’utilisation combinée d’inhibiteurs de PI3K avec ceux de l’EGFR inhibent efficacement l’activation de la voie des MAPK.

Afin de définir le rôle du module Gab1/SHP2 dans les cellules cancéreuses résistantes aux inhibiteurs de l’EGFR comme par exemple l’Iressa (ou Gefitinib), nous pourrions bloquer l’activité des différentes protéines composant ce module par l’utilisation d’ARN à interférence ciblant Gab1 ou SHP2, ou soit par des transfections transitoires de mutants dominants négatifs de Gab1 et de SHP2 ou soit par des infections adénovirales de ces mêmes mutants. Ensuite, nous pourrons mesurer les conséquences du blocage de l’activité de Gab1 et de SHP2 sur le phénotype tumoral de ces cellules. Pour cela, nous utiliserons les techniques d’analyse de la prolifération cellulaire par cytométrie de flux comme par exemple l’incorporation de BrdU ou l’analyse des différentes phases du cycle cellulaire par l’incorporation d’IP (iodure de propidium). De plus, nous pourrons évaluer le potentiel tumoral in silico par la technique de croissance en agar mou, et in vivo par l’utilisation de modèles de xénogreffes de tumeurs sur souris Nude. Nous déterminerons ainsi si le blocage de ces protéines parvient à lever la résistance des cellules de glioblastomes aux inhibiteurs de l'EGFR. Dans un deuxième temps, nous pourrons tester l’effet de la double inhibition de l’EGFR et de la PI3K par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de chacune des deux molécules pour tenter de lever la résistance aux inhibiteurs de l’EGFR. Nous regarderons en particulier l’impact de cette double inhibition sur l’activation des MAPK qui participe au développement tumoral. Par contre, une étude a permis d’identifier des mutations activatrices situées dans le domaine tyrosine kinase de l’EGFR (telles que L858R et delL747-P753insS) dans des cellules du cancer du poumon non à petites cellules. Ces mutations provoquent une sensibilité au gefitinib.(Lynch et al., 2004). Ainsi, en réponse à l’EGF, l’activation des mutants de l’EGFR est augmentée comparée à celle de l’EGFR

Perspectives non muté. L’activation de l’EGFR a été quantifiée en mesurant la phosphorylation de la tyrosine 1068, qui est un site de liaison de Grb2. Dans cette étude, ces mutations vont permettre une augmentation des sites de liaison de Grb2, par conséquent le module Gab1/SHP2 va être recruté par l’intermédiaire de Grb2. Par conséquent, l’activation des MAPK ne va pas dépendre de la PI3K, ce qui peut alors expliquer la sensibilité observée au gefitinib. Nous pourrons alors transfecter ces mutants de l’EGFR dans des lignées cellulaires ou utiliser des cellules résistantes aux inhibiteurs de l’EGFR afin d’étudier le mode de recrutement du module Gab1/SHP2 et par conséquent regarder s’il y a dépendance ou non de la PI3K dans l’activation Ras/MAPK. L’étude du mode de recrutement du module Gab1/SHP2 permettrait alors d’expliquer la résistance et l’efficacité des inhibiteurs de l’EGFR.

Dans le cas où notre modèle mécanistique serait retrouvé sur le plan physiopathologique, nos résultats présenteraient alors un intérêt clinique probable afin de mieux cibler l’efficacité des traitements. Il serait alors intéressant de procéder au criblage de cellules cancéreuses, présentant différentes mutations de l’EGFR, et de vérifier si le mécanisme de recrutement du module Gab1/SHP2 est extrapolable à ces différents types cellulaires cancéreux (comme par exemple des cellules des cancers colorectaux, des cellules de cancers du poumon non à petites cellules, des cellules de glioblastomes, des cellules de cancer du sein, les cellules des cancers ovariens, …). Ainsi, dans les cellules cancéreuses où l’activation résiduelle des MAPK va dépendre de la PI3K, une double inhibition par des inhibiteurs de PI3K et de l’EGFR sera nécessaire pour permettre la levée de la résistance aux inhibiteurs de l’EGFR. D’après une étude récente, un nouvel inhibiteur de la PI3K, le PI103, a été découvert (Raynaud FI et al., 2007).Cette étude montre que cet inhibiteur spécifique de la PI3K ne provoque aucune toxicité dans le modèle de xénogreffes de cancers ovariens et du sein, contrairement au LY294002 et à la wortmaninn. Le PI103 possède également un fort potentiel anti-angiogénique permettant ainsi de diminuer la progression tumorale (Raynaud FI et al., 2007). Il serait donc intéressant d’utiliser le PI103 en combinaison avec le gefitinib en traitement thérapeutique dans les cancers résistants aux inhibiteurs de l’EGFR.

Par conséquent, la mise en jeu du module Gab1/SHP2 par son mode de recrutement dans l’activation de la voie Ras/MAPK permettrait alors d’envisager l’élaboration d’une stratégie anti- cancéreuse. Il serait alors possible d’affecter spécifiquement les cellules tumorales en ciblant le recrutement de la protéine à la membrane sans produire de toxicité vis-à-vis des cellules saines qui n’utilisent pas ce module de signalisation. Nous pourrions alors transfecter dans des cellules cancéreuses du SiRNA Gab1 humain permettant de supprimer l’expression de Gab1 endogène, ou d’utiliser des adénovirus exprimant des mutants dominants négatifs de Gab. Nous devrions alors observer une inhibition de l’activation de la voie Ras/MAPK, ce qui devrait entraîner une

diminution de la prolifération tumorale. Donc, Gab1 pourrait devenir une cible thérapeutique intéressante.

La compréhension, d'un point de vue fondamental, de ces nouveaux mécanismes d'activation de la voie Ras/MAPK apparaît comme indispensable afin d’identifier de nouvelles cibles potentielles aboutissant à une pharmacologie anti-tumorale. Il serait intéressant de pouvoir caractériser le degré d'implication des protéines Gab1 et SHP2 dans différentes formes de cancers et de développer des inhibiteurs spécifiques de ces différentes protéines.

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