Pour résumer, ce travail de thèse s’est axé autour de trois parties.
La première partie concerne la caractérisation et la mise au point d’une matrice composite de polysaccharides contenant des particules d’HA dopées ou non en strontium. Nous avons défini le meilleur rapport entre le contenu minéral (particules de HA) et le contenu en polysaccharides. Seules les études in vivo réalisées en site ectopique et hétérotopique (modèle de condyle fémoral chez le rat) ont permis de définir le meilleur taux de substitution en strontium capable d’activer à la fois la néoformation osseuse et la vascularisation. Cette formulation correspond à 30% (p/p) de particules d’hydroxyapatite présentant un taux de substitution en strontium de 50%.
La seconde et la troisième partie de ce travail ont porté sur l’utilisation de ces nouvelles générations de matrices dans le cadre de l’application de la technique de Masquelet pour la reconstruction en territoires irradiés. La reconstruction de sites irradiés reste extrêmement complexe. Seuls les produits d’ingénierie tissulaire combinant des matrices, une composante cellulaire et / ou des facteurs ostéogéniques, ont la capacité de reconstruire de tels sites où les difficultés majeures restent : la taille critique de ces lésions et les dommages des structures cellulaires, vasculaires et nerveuses, causés par la radiothérapie.
Démontrer les performances de ces matrices composites constitue un véritable défi dans le domaine de la médecine régénérative. La technique de Masquelet et la membrane induite constituent des outils méthodologiques pertinents pour évaluer la performance de ces matrices injectables. Malheureusement, les difficultés rencontrées pour la mise en place de ces modèles expérimentaux n’ont pas permis de finaliser ces études dans les temps impartis. Les infrastructures nécessaires à la mise en place de ces modèles sont également un frein pour la réalisation rapide de ces protocoles pré-cliniques.
Outre la finalisation des études expérimentales en cours chez le rat et le mini-porc, les perspectives de ce travail concernent les points suivants :
Synthèse des particules d’hydroxyapatite dopées ou non en strontium
Les particules d’HA, dopées ou non en strontium, ont été synthétisées suivant une méthode de précipitation en milieu aqueux, à une température de 90°C. Cette technique figure parmi un grand nombre de procédés permettant de réaliser la synthèse d’HA. Cependant, nous pourrions comparer d’autres méthodes de synthèse d’HA, telles que celles décrites par Sadat-Shojai et al. [2]. Cette revue met particulièrement en évidence l’influence du mode de synthèse sur la forme, la taille et la bioactivité des particules obtenues. Les propriétés des matrices contenant les particules d’HA pourraient être éventuellement améliorées avec des tailles, des formes différentes de ces particules. De même, le mode de dispersion de ces
particules, en essayant de réduire la formation de ces agrégats pourrait améliorer les propriétés biologiques de ces matrices composites. Enfin, il serait intéressant de déterminer plus finement la composition des échantillons d’HA synthétisés.
Porosité de la matrice implantée en site ectopique
Nous avons également mentionné dans l’introduction que la porosité des matériaux de substitution osseuse avait une grande importance pour permettre l’invasion tissulaire. En effet, lorsque les pores sont compris entre 100 et 350 µm, la mise en place de la vascularisation, et la colonisation cellulaire du matériau est plus importante. Les matrices que nous avons implantées en site sous cutané possèdent des pores allant de 10 à 400 µm. La porosité de ces matrices influence les propriétés mécaniques de ces matrices. Il en est de même pour sa dégradabilité. Obtenir un équilibre entre ces deux paramètres reste un défi difficile à relever. L’utilisation de billes de diamètre entre 250 µm et 500 µm a permis, en partie, de résoudre les problèmes d’invasion cellulaire puis tissulaire. Du tissu ostéoïde se forme au contact, autour et entre les billes, de la périphérie vers le centre de l’implant. Néanmoins, ces billes de polysaccharides sont toujours présentes après 8 semaines d’implantation dans le modèle de lésion du condyle fémoral. Il serait intéressant d’optimiser leur dégradation en jouant sur les étapes de réticulation de ces matrices.
Diamètre des billes implantées en site orthotopique
Dans ce travail, ainsi que dans les travaux précédents, nous avons choisi d’utiliser des billes allant de 250 à 500 µm. Cependant, il serait intéressant de tester des billes de tailles inférieures et / ou supérieures à celles-ci, afin de voir si cela modifie la colonisation tissulaire du matériau. Nous avons déjà testé des billes dont la taille est comprise entre 100 et 300 µm injectées au sein du défaut condylaire de fémur de rats. Aucune différence en termes de volume de minéralisation n’a pu être observée, que ce soit en présence ou non de strontium.
Choix des cellules utilisées pour l’étude in vitro et choix des gènes étudiés en qPCR
Lors de la première partie de ce travail, nous avons choisi d’étudier l’effet de la présence du strontium sur l’expression des gènes spécifiques de la lignée ostéoblastique. Pour cela, nous avons utilisé des cellules souches mésemchymateuses humaines ensemencées dans les matrices. Nous avons choisi de quantifier l’expression de deux gènes (runx2 et OPN) impliqués dans la différenciation ostéoblastique précoce et tardive induite par le strontium. Cependant, il aurait également été intéressant d’étudier des gènes tels que l’ostéocalcine, ou l’ALP. Les réponses des cellules souches endothéliales humaines (EPCs) en présence de strontium auraient également pu être étudiées. En effet, le strontium est connu pour son double rôle dans l’ostéoblastogénèse et dans la promotion de l’angiogénèse. De ce fait, les expressions
des marqueurs spécifiques à l’angiogénèse tels que VEGF, le facteur vWF ou encore le CD31 pourraient être analysés [298, 299].
Etude des voies de signalisation
Un autre point important, auquel nous ne nous sommes pas intéressés au cours de ce travail, concerne les différentes voies de signalisation impliquées dans le mode d’action du strontium. En effet, il serait intéressant de mettre en évidence la ou les voies de signalisation activées par le strontium présent dans ces matrices. La voie du CaSR reste une cible de choix dans ce travail [197, 198] ainsi que les voies OPG/RANKL et la voie Wnt.
Etude du relargage du strontium par les matrices
En lien avec le paragraphe précédent, la cinétique de relargage de strontium fait également partie des points importants à explorer. In vitro, le relargage du strontium peut être étudié dans des solutions physiologiques, in vivo, son relargage reste plus difficile à appréhender.
Choix du conformateur utilisé dans la technique de Masquelet
Durant la seconde partie de ce travail, nous avons montré que le silicone pouvait être utilisé comme conformateur en remplacement du PMMA à la première étape de la technique de Masquelet. Cependant, bien que le silicone n’induise pas de changements structuraux ni histologique de la membrane induite, il n’induit pas un bénéfice significatif en comparaison du PMMA en terme de facilité de manipulation, comme le laissait penser les études précédentes réalisées chez le rat en site ectopique [61]. Ainsi, pour les expériences in vivo suivantes, nous avons choisi de continuer à utiliser le PMMA, actuellement utilisé en routine clinique pour cette technique. Cela nous permet de pouvoir comparer les résultats obtenus avec les données de la littérature.
Protocole de radiothérapie et effet sur les propriétés biologiques de la membrane induite Nous avons pu observer que le traitement par radiothérapie des rats opérés n’avait pas d’effets secondaires sur ces animaux, mais réduisait significativement l’épaisseur de la membrane induite ainsi que sa vascularisation. A l’opposé, les quantités de BMP2 et de VEGF présentes dans les extraits protéiques de la membrane induite ne sont pas modifiées par la radiothérapie. En revanche, l’activité de la phosphatase alcaline des MSCs, en présence de ces extraits protéiques, est significativement plus faible en présence des extraits des membranes induites provenant de rats irradiés.
Les rats supportant bien les doses quotidiennes auxquelles ils ont été soumis, nous pourrions envisager d’augmenter ces doses de radiations afin de réduire le nombre de jours de traitement.
En conclusion, ce travail ouvre d’importantes perspectives dans le domaine de l’ingénierie tissulaire osseuse et dans le développement de nouvelles matrices « prêtes à l’emploi » pour des applications en chirurgie orale et orthopédique.
Dès lors que ces essais précliniques auront été effectués du petit au gros animal, le transfert de cette nouvelle génération de matrices de polysaccharides pourra alors être proposé. La société SILTISS, qui produit actuellement ces matrices composites (non dopées en strontium), pourra prendre en charge son développement et sa production industrielle en conditions GMP, son étude de biocompatibilité et son transfert vers la clinique.