Conclusion

Grâce à l’optimisation de l’expression de GH*, des quantités suffisantes d’enzymes ont pu être produites pour permettre la caractérisation fonctionnelle et structurale de l’enzyme. L’optimisation des étapes de purification a permis d’obtenir une enzyme pure.

La recherche d’activité de l’enzyme a permis d’identifier le RAX comme étant le meilleur substrat (parmi ceux testés) pour la caractérisation de l’enzyme. Avec ce substrat les paramètres optimaux de l’enzyme ont été déterminés. Le pH optimal de fonctionnement de GH* est de 5,5 et la température optimale est de 45 à 50 °C. Les conditions d’utilisation de l’enzyme ont donc été fixées en tampon phosphate-citrate (43 mM citrate, 114 mM phosphate) à pH 5,5 à 45 °C.

D s

139 L’analyse des produits d’hydrolyse du RAX par GH* nous a permis d’identifier l’activité de GH*. Il s’agit d’une endo-β-1,4-xylanase. Et l’analyse de l’hydrolyse de xylooligosaccharides par GH* nous a permis d’émettre l’hypothèse que GH* aurait une préférence pour les xylooligosaccharides de DP supérieurs à 4.

Cependant l’activité de GH* reste 10 à 2000 fois plus faible que l’activité de nombreuses xylanase déjà caractérisées (Paës et al. 2007 ; Paës, Berrin, et Beaugrand 2012 ;Gong et al. 2013;Alvarez, Goldbeck, dos Santos, et al. 2013;Song et al. 2014;Ko et al. 2016).

L’analyse des produits d’hydrolyse des xylooligosaccharides permet de faire une hypothèse quant à l’organisation du site catalytique de l’enzyme et la nécessité d’avoir certains sous-sites occupés pour l’activité de GH* (figure 58).

En effet, l’enzyme produit majoritairement 2 molécules de X3 à partir d’une molécule de X6 et peu de X4 + X2. D’autre part, il y a exclusivement du X3 + X2 produit à partir de X5. Enfin à partir du X4, on obtient majoritairement du X2. Le X3 quant à lui n’est pas hydrolysé par GH*. Tout cela implique que les sous-sites -2 et +2 doivent être occupés car il n’y pas de libération de X1 quel que soit le substrat hydrolysé.

L’occupation du site -3 et du site +3 doit aussi jouer un rôle important car on voit que le X4 n’est pas le substrat préférentiel puisqu’après 24 h d’hydrolyse seulement le tiers du X4 de départ a été hydrolysé.

140 A

s

B s

141 Figure 58 : Schéma des sous-sites de fixation des ligands hypothétiques de GH*. Positions favorisées (A), positions possibles (B) et positions défavorables (C) des xylooligosaccharides dans le site de fixation de GH*. Les sous-sites sont représentés en bleu, les xyloses en vert et le site où se fait l’hydrolyse est pointé par la flèche jaune. L’extrémité réductrice des oligosaccharides se situe du côté des sous-sites positifs et l’extrémité non-réductrice du côté des sous-sites négatifs.

Analyser les 2 pics non attribués (Unk 1 et 2) issus de l’hydrolyse du RAX par GH* afin de les identifier pourrait nous permettre d’avoir plus d’informations sur le site catalytique de l’enzyme. En effet, si ces produits sont linéaires, cela peut impliquer la présence d’autres sous-sites dans la continuité de ceux déjà identifiés. Si ces produits sont ramifiés, cela va impliquer la présence de sous-sites différents. La nature et la localisation des ramifications peut avoir un effet sur l’activité de GH*.

Tester des xylooligosaccharides plus longs tels que les X7 et X8 et des xylooligosaccharides longs et ramifiés pourrait permettre de confirmer ces hypothèses et aussi de mieux comprendre le mécanisme de l’enzyme.

Enfin obtenir la structure cristallographique d’un mutant inactif de GH* en présence d’un substrat tel que le X6 ou le X5 nous permettrait aussi de mieux comprendre le mode d’action de l’enzyme.

C s

142 Finalement, quand on revient au fosmide sur lequel GH* a été identifiée, on constate que les autres GH présentes pourraient participer à la dégradation de substrats avec GH*. En effet, les autres protéines sont une GH1 (β-glucosidases majoritairement) et une GH4 (6-phospho-β-glucosidases majoritairement). Ces familles d’enzymes regroupent d’autres activités enzymatiques telles que β-xylosidase pour la famille 1 et α-glucuronidase pour la famille 4. Une β-xylosidase pourrait prendre en charge les X2 et X3 produits par GH* pour finir leur dégradation. Une α-glucuronidase pourrait hydrolyser les ramifications constituées d’acide glucuronique présentes sur les xylanes et ainsi permettre à GH* d’hydrolyser la chaîne principale de ces polysaccharides.

Toutefois, le fosmide a été identifié par sa capacité à hydrolyser le X-cellobioside, cette activité d’hydrolyse ne provenant pas de GH*, elle pourrait provenir de la GH1 (β-glucosidase). De nombreux transporteurs à hexoses-phosphate ont également été annotés et peuvent être mis en relation avec l’activité 6-phospho-β-glucosidase de la GH4. Ces différentes activités sont difficiles à mettre en relation avec celle de GH* à moins que la GH1 ne possède une double activité β-glucosidase et β-xylosidase, ce qui a déjà été observé et qui est rendu possible par la proximité structurale qui existe entre les xylooligosaccharides et les glucooligosaccharides (Mattéotti et al. 2011).

143

Chapitre III : Etude structurale de GH*

I. Introduction

La cristallographie est, depuis de nombreuses années, une des techniques les plus précises pour résoudre la structure tridimensionnelle de protéines. De nombreuses études structure-fonction ont permis de comprendre comment l’organisation tridimensionnelle d’une protéine peut être impliquée dans l’activité de celle-ci. Les études structurales de protéines ont notamment permis d’identifier les acides aminés impliqués dans la reconnaissance et/ou le maintien du substrat ainsi que ceux responsables de l’activité de la protéine (Cartmell et al. 2011b ; Zheng et al. 2012). Des études structurales ont aussi permis d’identifier les différentes étapes de mécanismes réactionnels (Mark et al. 2001 ; Amaya et al. 2004).

La connaissance de la structure tridimensionnelle d’une protéine pour laquelle on n’a que très peu d’informations peut permettre d’émettre un certain nombre d’hypothèses. Si la protéine a un repliement classique de familles d’enzymes, cela peut permettre d’identifier les résidus catalytiques hypothétiques ou encore orienter vers un type de substrat. Ces hypothèses peuvent être énoncées après analyse comparative entre la protéine d’intérêt et des protéines présentant une certaine homologie structurale ou en analysant la protéine elle-même (répartition des charges, présence de sillons ou de cavités, localisation de boucles potentiellement flexibles…).