Nous avons pu voir dans le chapitre II que GH* est une xylanase active sur arabinoxylane. En effet GH* libère des xylooligosaccharides allant du xylobiose au xylohexaose avec majoritairement du xylotriose à partir d’arabinoxylane de blé et de seigle. Il a aussi été démontré que l’enzyme est capable d’accommoder et d’hydrolyser des xylooligosaccharides avec une préférence pour les oligosaccharides de DP supérieur à 4 puisque l’activité est plus forte sur xylohexaose que sur xylopentaose et que sur xylohexaose. L’activité la plus élevée déterminée à ce jour est donc sur xylohexaose mais reste faible par rapport à des xylanases classiques des familles GH10 ou 11. Comme l’activité est meilleure sur des xylooligosaccharides de DP supérieur à 4 et que celle-ci augmente avec la longueur de la chaîne, il est possible que l’activité de GH* soit encore plus grande sur des xylooligosaccharides plus long tels que des X7, X8, voire plus longs encore. L’activité n’a pas pu être testée sur des xylooligosaccharides linéaires de DP supérieur à 6, ni sur des xylooligosaccharides ayant un DP de 5 minimum et ramifiés car nous n’avions pas accès à de tels substrats non commerciaux.
III. Conditions de cristallisation
Une fois produite et purifiée en deux étapes de chromatographie successives (affinité et filtration sur gel) (cf. chapitre II), GH* est concentrée par centrifugation sur concentrateur ayant un seuil de coupure de 10 kDa. La protéine est conditionnée dans un tampon 20 mM citrate de sodium, 100 mM NaCl, pH 5,0. Ce tampon a été identifié par DSF comme étant le
145 tampon dans lequel la protéine à le Tm le plus élevé (58,5 °C). Or, plus le Tm est élevé et plus la probabilité d’obtenir des cristaux de protéine est élevée (Ericsson et al. 2006 ; Reinhard et al. 2013). Pour les premiers essais de cristallisation, GH* a été concentrée à 12,5 mg/ml afin de pouvoir mener suffisamment d’essais de cristallisation. Ainsi 4 cribles commerciaux (JCSG I à IV, Qiagen) ont été utilisés pour cribler une large gamme de conditions. Les premiers essais ont donné des petits cristaux dans plusieurs conditions. Les plus intéressants ont poussé dans la condition contenant une solution de cristallisation 0,2 M d’acétate de calcium et 20 % p/v de PEG 3350 (figure 59A) (tableau 13).
Comme de nombreuses gouttes contenaient des précipités, ce qui peut indiquer une trop grande concentration en protéine, de nouveaux essais donc ont été menés en diminuant la concentration en protéine de 12,5 à 8 mg/ml, en utilisant les mêmes cribles commerciaux. De nouvelles conditions de cristallisation notamment avec 0,2M d’acétate de magnésium, 20 % p/v PEG 3350, sont apparues (figure 59C) (tableau 13) et des cristaux moins nombreux mais plus gros ont été obtenus dans les conditions déjà identifiées lors des premiers essais (0,2 M acétate de calcium, 20 % p/v PEG 3350) (figure 59B) (tableau 13). Diminuer la concentration en protéine a donc permis d’obtenir des cristaux de même forme mais dont les dimensions sont plus grandes.
Par la suite, de nombreux essais manuels ont été menés, en faisant varier la concentration en sel et en PEG 3350 (tableau 14), afin d’optimiser les conditions de cristallisation mais n’ont pas permis d’accroître la taille des cristaux.
A
B
146 Figure 59 : Microphotographie des gouttes de cristallisation observées en lumière visible (image de gauche) et en UV (image de droite) pour différentes conditions. A. Cristaux de GH* obtenus à 12,5 mg/ml en présence de tampon 0,2 M acétate de calcium, 20% p/v PEG 3350. B. Cristaux de GH* obtenus à 8 mg/ml en 0,2 M acétate de calcium, 20 % p/v PEG 3350. C. Cristaux de GH* obtenus à 8mg/ml en 0,2 M acétate de magnésium, 20 % p/v PEG 3350.
Tableau 13 : Conditions de cristallisation des cribles commerciaux ayant permis l’obtention des premiers cristaux.
147 Tableau 14 : Conditions de cristallisation optimisés manuellement en boites 24 puits.
Différents cristaux obtenus avec les cribles commerciaux présentés en figure 59 ont donc été prélevés et congelés en utilisant la solution de réservoir supplémentée en PEG 400 à une concentration finale de 15 % (v/v) afin de les cryoprotéger. Les cristaux ont été testés sur le site synchrotron de l’ESRF (Grenoble, France). Ces cristaux présentaient un pouvoir diffractant faible compris entre 5 et 3,5 Å.
De nouveaux essais ont donc été menés en diminuant encore la concentration en protéine à 3,4 mg/ml. De plus, comme entre-temps, des activités faibles avaient été identifiées pour GH*, les essais ont été réalisés en présence de L-arabinose ou de D-galactose, pour lesquels une faible activité sur pNP-monosaccharide avait été observée. De nombreux cribles (JCSG I à IV, PEG I et II, pHclear I et II, Morpheus et Nucleix) ont été utilisés par Claire Raingeval, lors de son stage de M1, et ont permis d’obtenir des cristaux. En présence de D-galactose, les cristaux ont la même forme que précédemment mais sont plus grands (figures 60A) (tableau 13) et n’ont pas été obtenus dans les mêmes conditions : 0,2 M chlorure de magnésium, 0,1 M Tris pH 8,5, 30 % p/v PEG 4000. En présence de L-arabinose et à plus faible concentration en protéine, des cristaux ont poussé dans une nouvelle condition (0,2 M chlorure d’ammonium, 20 % p/v PEG 3350). Ces cristaux n’ont pas la même forme que ceux obtenus jusqu’alors (figure 60B) (tableau 13).
148 Figure 60 : A. Cristaux obtenus avec GH* à 3,4 mg/ml en présence de 0,2 M chlorure de magnésium, 0,1 M Tris pH 8,5 et 30 % p/v PEG 4000. B. Cristaux obtenus avec GH* à 3,4 mg/ml en présence de 0,2 M chlorure d’ammonium, 20 % p/v PEG 3350. A gauche la goutte visualisée en lumière visible et à droite en UV.
Ces nouveaux cristaux ont été prélevés et congelés en utilisant la solution de cristallisation contenant 100 mM de L-arabinose ou de D-galactose permettant d’assurer leur cryoprotection. Ils ont été testés sur site synchrotron (ESRF, Grenoble, France) et un cristal a permis d’obtenir un jeu de données ayant une résolution maximale de 1,55 Å. Ce cristal est un fragment de la baguette présentée sur la figure 60B.
Ces données semblent indiquer que le L-arabinose joue un rôle dans la cristallisation. Deux autres éléments qui semblent essentiels à la cristallisation sont la présence de PEG (3350 ou 4000) à 20% p/v (voire 30% p/v) et la présence de sel à 0,2M car toutes les conditions dans lesquelles les meilleurs cristaux ont été obtenus comportent du PEG et du sel.