Os SNPs, também designados de "Single Nucleotide Substitution" (CARLSON et al., 2001) e comummente apelidados de “snips”, consistem em diferenças pontuais de
um nucleótido nas sequências homólogas de DNA, cuja frequência na população tenha um valor mínimo de 0,01. Este tipo de variação é a mais comum no genoma humano, em média uma por cada 1000 a 2000 pb, localizando-se tanto no DNA codificante como no não codificante (SACHIDANANDAM et al., 2001). Até à data, e no que diz respeito ao
genoma humano, cerca de 11 milhões de SNPs estão disponíveis em bases de dados públicas3. Nos animais domésticos são poucos e limitados na extensão os estudos efectuados com vista a estimarem a frequência com que ocorrem os SNPs, mas os resultados obtidos em algumas espécies, nomeadamente em bovinos (KONFORTOV et al., 1999; HEATON et al., 2001) e suínos (GRAPES et al., 2006), sugerem uma ordem de
grandeza idêntica à registada em humanos. A abundância e a ubiquidade destas diferenças pontuais estão na base da enorme expectativa que recai sobre elas, uma vez que se espera poder utilizá-las, como marcadores na identificação de genes responsáveis pela predisposição de certos indivíduos a determinadas doenças, recorrendo, para o efeito, ao mapeamento por desequilíbrio de ligação (GORDON e OTT, 2001; SYVANEN,
2001). Por outro lado, o facto de nas regiões codificantes também surgirem SNPs, torna possível a sua associação directa com uma eventual alteração da função da respectiva proteína, o que, conjuntamente com um conhecimento do padrão de herança, os tornaria adequados para uma estratégia de diagnóstico (JI e MANAK, 2002). Nos animais
domésticos é grande a expectativa gerada em torno da possibilidade de estabelecer uma associação de genótipos (ou de haplótipos) de SNPs ao fenótipo produtivo, o que
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permitiria a sua utilização numa estratégia de selecção assistida por marcadores com elevada eficiência (SCHENKEL et al., 2005; SCHENKEL et al., 2006).
Conceptualmente, os SNPs não são propriamente marcadores novos, uma vez que a existência deste tipo de polimorfismo está desde há muito descrita, principalmente no que toca a regiões codificantes que se relacionam com doenças humanas. As metodologias clássicas usadas para detectar estas mutações requerem uma separação dos diferentes alelos por electroforese em gel, o que torna o processo demorado. Estas metodologias podem ser divididas em dois tipos: as que detectam variação em sequências não caracterizadas, ditas de varrimento (scanning) e as que identificam variações de sequências específicas previamente caracterizadas, designadas por específicas (NATARAJ et al., 1999). As primeiras incluem, entre outras, o polimorfismo
de conformação monocatenária (SSCP - Single-Strand Conformation Polymorphism) (ORITA et al., 1989; SUNNUCKS et al., 2000), a análise heteroduplex (HA - Heteroduplex Analysis) (NATARAJ et al., 1999), a electroforese em gel de gradiente desnaturante
(DGGE - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (NOLL e COLLINS, 1987), e a
electroforese em gel de gradiente de temperatura (TGGE- Temperature Gradient Gel
Electrophoresis) (THEISSEN et al., 1993). Do segundo tipo fazem parte os métodos de
extensão de iniciadores ou minisequenciação (primer extension or minisequencing), a amplificação alelo-específica (allele-specific amplification), a hibridação oligonucleotídica alelo-específica (allele-specific oligonucleotide hybridization) e o ensaio de ligação oligonucleotídico (oligonucleotide ligation assay). As versões originais destas metodologias analisavam normalmente apenas um SNP de cada vez, num reduzido número de indivíduos, o que, aliado ao facto de possuírem uma natureza bi-alélica, os tornava pouco atractivos como marcadores genéticos. Nos últimos 10 anos tem-se assistido ao aparecimento de um grande número de variantes das metodologias atrás referidas, principalmente das do segundo tipo, muito mais expeditas, em resultado de uma conjugação inteligente dos avanços na microelectrónica, na bioquímica, na análise de imagem e na bioinformática, os quais tornaram possível a análise de um grande número de SNPs em simultâneo. Estas variantes foram recentemente alvo de revisão (NOLLAU e WAGENER, 1997; CARLSON et al., 2001; KWOK, 2001; SYVANEN,
2001; LIBERLES, 2002; VIGNAL et al., 2002; STOUGHTON, 2005; SYVANEN, 2005). Não
estando a descrição individualizada destas metodologias no âmbito desta tese, pode-se referir que em termos globais, elas comportam várias etapas que conjugam três aspectos: o princípio de reacção, o formato do ensaio ou fase de separação e o método
de detecção. A Figura 7 mostra como cada um dos onze métodos, apontados como exemplo, resulta da combinação de cada um desses três aspectos. Cada método apresenta vantagens e limitações e nenhum deles é ideal para todas as aplicações (KWOK, 2001; SYVANEN, 2001).
Figura 7. Métodos utilizados na genotipagem dos SNPs (adapatado de SYVANEN, 2001).
Apesar destes avanços, na prática, para que o uso dos SNPs se imponha como alternativa aos microssatélites, é necessário aumentar ainda mais a eficiência de genotipagem dos SNPs e, principalmente, reduzir o seu custo. Por outro lado, é também preciso aumentar o número de SNPs caracterizados e alargar o leque de espécies com informação nas bases de dados (SHERRY et al., 1999). Os projectos mundiais de
sequenciação de genomas têm tido um impacto significativo, mas o número de espécies é ainda muito restrito, pelo que têm vindo a ser desenvolvidas novas abordagens com vista a tirar partido da informação desses projectos, com base na constatação da
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espécies próximas (PRIMMER et al., 2002; AITKEN et al., 2004; GRAPES et al., 2006;
KIJAS et al., 2006).
Recentemente, foram publicados alguns trabalhos que apontam no sentido em que o uso dos SNPs não só era adequado ao estudo da história evolutiva e demográfica de populações, como também apresentava algumas vantagens no que se refere aos microssatélites, donde se destaca o facto de apresentarem uma taxa de mutação inferior relativamente aos segundos, facto que resultaria numa menor probabilidade de ocorrência de homoplasia (KUHNER et al., 2000; BRUMFIELD et al., 2003; NIELSEN e
SIGNOROVITCH, 2003; MORIN et al., 2004). Em contrapartida, e uma vez que, na maior
parte das espécies, incluindo as de animais domésticos, o número de SNPs caracterizados era ainda limitado, esses autores alertaram também para o risco de ser introduzida alguma distorção (ascertainment bias)nos resultados obtidos, em virtude de no processo prévio de identificação dos SNPs serem detectados, preferencialmente, os mais polimórficos, devido ao número reduzido de indivíduos envolvidos na pesquisa inicial. Contudo, esta limitação será facilmente superada mediante a progressiva caracterização de mais SNPs.
Assim, à medida que forem ultrapassadas as limitações de índole económica, pelo custo elevado do equipamento necessário à genotipagem dos SNPs e for alargado o leque de informação disponível sobre estes marcadores, será de esperar que eles venham a ter um papel de relevo nas várias áreas de estudo onde o uso de marcadores moleculares seja justificável.
Relativamente às espécies de animais domésticos, nos últimos anos tem-se assistido a um incremento significativo na disponibilidade de informação molecular em várias bases de dados (FRIES e DURSTEWITZ, 2001; WHEELER et al., 2005; BENSON et al., 2006). No entanto, devido ao elevado investimento financeiro e à necessidade de optimização de protocolos que os novos métodos de genotipagem de SNPs implicam, o número de trabalhos publicados envolvendo estas espécies é ainda muito restrito, incidindo numa perspectiva de associação dos SNPs a características produtivas (SCHENKEL et al., 2005; SCHENKEL et al., 2006), na análise de paternidade (HEATON et al., 2002; WERNER et al., 2004), no mapeamento genético (CALVO et al., 2006) e
poucos têm sido os que aportam como objectivo o estudo da diversidade e da história evolutiva dos animais domésticos (HERRAEZA et al., 2005). Contudo, parece unânime
animais domésticos serão ultrapassadas tornando possível produzir mais uma perspectiva sobre a história evolutiva dos mesmos.