4. BRCA1 PROTÉINE CENTRALE DE LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE
4.4 Le complexe B
Le complexe B est formé de BRCA1, BRIP1 (BRCA1 Interacting Protein C-terminal helicase 1 également appelé FANCJ ou BACH1) et TOPB1 (Figure 9). BRIP1 est une hélicase appartenant à la famille des RecQ DEAH dont le rôle principal est de fixer et dérouler l’ADN.
Le complexe B permet d’initier la réparation homologue en déroulant l’ADN aux niveaux des cassures doubles brins. Il coordonne également les déplacements de Rad51 sur le nucléofilament 29.
Figure 10 : Composition du complexe B (adapté de Wang 2012)
4.5 Le complexe C
Le complexe C est formé par la protéine CtIP (C-terminal Intarcting Protein) et par le complexe MRN, constitué des protéines NBS1, MRE11 (Meiotic REcombination 11) et RAD50 29 (Figure 10).
CtIP est une protéine nucléaire essentielle au déroulement du cycle cellulaire et au maintien de l’intégrité du génome
42. Un des premiers rôles de CtIP est de promouvoir le passage de la phase G1 à S lors du développement
embryonnaire en se liant au promoteur de gènes impliqués dans le passage des points de contrôle du cycle cellulaire
47. Lorsque CtIP interagit avec les protéines de la famille Rb, on observe l’inhibition de certains facteurs de
transcription de manière à limiter la prolifération cellulaire 47.
MRE11 est une protéine nucléaire qui intervient dans la réparation des cassures doubles brins de l’ADN ainsi que dans le maintien de la longueur des télomères. Elle possède une activité 3’-5’ exonucléase mais également une activité 5’-3’ endonucléase ce qui lui permet d’intervenir à la fois dans réparation par NHEJ, lorsqu’elle se complexe avec Rad50, et dans la réparation par HR lorsqu’elle s’associe avec la ligase E3.
NBS1 est associée au syndrome de Nijmegen, caractérisé par une instabilité chromosomique, un retard de la croissance, une déficience immunitaire et une prédisposition au cancer.
Enfin, Rad50 est essentielle à la réparation des cassures doubles brins l’ADN, à l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire, à la recombinaison méiotique et au maintien des télomères. Des études ont montré que cette protéine est nécessaire à la viabilité et à la croissance cellulaire 47.
La première étape de formation du complexe C est l’activation de CtIP par phosphorylation 48. Une fois activée, CtIP
se fixe à un domaine BRCT de BRCA1 par reconnaissance du motif SPxF. C’est à ce moment qu’intervient le complexe MRN qui va permettre à BRCA1 d’être acheminée aux sites des cassures doubles brins de l’ADN par le biais d’une interaction CtIP/NSB1 31. CtIP joue donc le rôle de médiateur entre BRCA1 et le complexe MRN,
22 déacétylations de CtIP vont favoriser la résection des extrémités cassées de l’ADN, première étape de la réparation par recombinaison homologue.
Le duo BRCA1/CtIP est également impliqué dans la réparation par jonction des d’extrémités non-homologues lors de la phase G1 27, notamment pendant la translocation chromosomique. La présence de mutations dans les domaines
BRCT de BRCA1 nuit à la liaison avec CtIP, ce qui diminue l’efficacité de la réparation 31.
Figure 11 : Composition du complexe C (adapté de Wang 2012)
Les complexes A, B et C s’associent avec BRCA1 via le domaine BRCT de façon mutuellement exclusive, ce qui permet à chacun de jouer son rôle dans les étapes précédant la réparation des cassures doubles brins de l’ADN par HR. Le but commun de ces trois complexes est de préparer l’ADN pour l’invasion du brin endommagé au niveau de la chromatide sœur.
5. PROBLÉMATIQUE
L’identification de nouveaux gènes de susceptibilité est essentielle pour comprendre les mécanismes cellulaires qui génèrent les tumeurs, pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et pour améliorer le diagnostic ainsi que le suivi des patientes.
On estime qu’une fraction inexpliquée du risque génétique de cancer du sein est susceptible d'être expliquée par des variants plus rares de risque intermédiaire. Tel que démontré par l’analyse des gènes ATM, CHEK2, BRIP1 et
PALB2, les variants délétères chez ces gènes ne confèrent pas un risque suffisamment élevé, ou sont trop rares,
pour être identifiés par des études de linkage, et sont également trop rares pour être détectés par des GWAS. Très peu de gènes ont été analysés jusqu’à présent dans cette catégorie de variants, et il est donc probable que beaucoup d'autres loci de susceptibilité de ce type sont encore à identifier et pourraient expliquer une proportion importante du risque de cancer du sein.
L'approche la plus efficace pour identifier des gènes de susceptibilité de risque intermédiaire est le criblage de mutations dans le cadre d’études cas-témoins. Cette approche comporte 4 étapes principales:
1. la sélection de gènes candidats en fonction de leur rôle biochimique,
2. le criblage des gènes pour la présence de variants dans la région codante et les jonctions introns- exons dans une série de cas de cancer du sein et de témoins appariés au niveau de l’ethnicité, 3. l’analyse détaillée de la séquence est effectuée selon les variants observés dans le but de les
catégoriser quant à leur probabilité d'interférer avec la fonction de la protéine codée par le gène, 4. la somme des fréquences des variants les plus susceptibles d'altérer la fonction des gènes est
comparée dans les cas de cancer du sein par rapport au contrôle. Si celle-ci est significativement plus élevée dans les cas que chez les contrôles, il est donc probable qu’il s’agisse d’un gène de susceptibilité. Les analyses bio-informatiques qui comparent la distribution gradée des substitutions dans les cas de cancer vs. les contrôles peuvent identifier de nouveaux gènes de susceptibilité en complétant les analyses de mutations délétères.
L’ensemble des gènes codant pour des protéines impliquées dans la réparation des cassures doubles brins de l’ADN sont de bons gènes candidats à la susceptibilité au cancer du sein. C’est pour cette raison que nous avons sélectionné le gène Abraxas codant pour une protéine qui interagit avec BRCA1 et qui est l’élément central du complexe A. De plus, une étude de liaison réalisée dans des familles finlandaises à haut risque de cancer a identifié la mutation R361Q dans 3 familles sur 125 et a été associée au risque de développer la maladie. À noter qu’il a été démontré que l’utilisation de cas familiaux augmente considérablement la puissance de détection de risque conféré par des variants comparativement à une étude de taille similaire mais dont les cas ne pas sélectionnés pour ce critère.
24 L’objectif premier de mon projet de maitrise était de déterminer si Abraxas peut être un gène de susceptibilité au cancer du sein de risque intermédiaire par une étude de type cas/témoins, où les cas ne possèdent pas une histoire familiale de cancer du sein. Pour ce projet l’étude du BCFR s’adaptait parfaitement car elle est composée de 1332 cas sans histoire familiale de cancer du sein, non porteurs de mutations dans les gènes BRCA1/BRCA2, sélectionnés selon l’âge au diagnostic (à ou avant 45 ans), selon l’origine (Caucasien, Asiatique de l’est, Afro-Américain ou Latino) et selon l’origine de leurs grands-parents. Les 1121 témoins ont été choisis de façon à faire correspondre les critères de sélection avec un cas. Le deuxième objectif du projet était de vérifier si la mutation R361Q, identifiée dans les familles finlandaises à haut-risque de cancer du sein, était retrouvée parmi les cas de notre étude.
Approches expérimentales :
Pour identifier les variants, les 9 exons codants d’Abraxas ont été criblés par la méthode de « High Resolution
Melting Curve ». Cette technique qui consiste à identifier des individus porteur d’une variation en fonction de la
température d’association des brins d’ADN d’un amplicon est réalisée en trois étapes : Tour d’abord on réalise une PCR dans laquelle on ajoute du SYBR Green, un agent fluorescent, qui va s’intercaler entre les brins d’ADN à chaque cycle d’amplification. Les PCR ont été mises au point pour les 9 exons d’Abraxas, et l’amplification a été réalisée sur le LightCycler480 de Roche®. Une fois l’amplification terminée, on augmente la température à 95°C pour séparer les brins d’ADN, puis on diminue progressivement la température pour reformer les doubles-brins d’ADN des amplicons. La diminution de la température est progressive pour favoriser la formation des hétéroduplexes, dans le cas où l’individu présenterait une variation dans l’amplicon étudié. C’est dans cette phase que le SYBR Green va jouer son rôle. En effet, pendant la re-formation des doubles brins d’ADN le SYBR Green va s’insérer entre les brins, comme pendant la PCR, et le LightCycler480 va mesurer l’intensité de fluorescence. On observe une diminution drastique de l’intensité de fluorescence au moment de la demi-dénaturation des brins. L’analyse des échantillons permet d’identifier les individus pour lesquels la température d’association des brins est différente, ce qui indique la présence d’un variant chez ces individus pour un amplicon donné. Pour identifier la nature de la variation il faut ensuite séquencer l’amplicon d’intérêt par séquençage de Sanger.
Il s’agit actuellement de l’approche la plus avantageuse en termes de coût-efficacité. En effet, cette méthode simple basée sur la détection de variant en mesurant la température de dissociation des amplicons de PCR d’une région du génome permet d’analyser 384 échantillons en même temps. Les échantillons présentant une température de dissociation différente sont ensuite séquencés par la méthode de Sanger pour identifier le variant. Une fois les conditions de PCR mise au point, il est facile d’analyser 3 plaques de 384 échantillons en une journée. La présence d’un SNP fréquent dans l’amplicon d’intérêt peut représenter un inconvénient en masquant des variants rares qui passeront inaperçu lors de l’analyse. Progressivement cette technique va laisser place au séquençage de nouvelle génération (NGS) dont les coûts baissent année après année.
Les algorithmes Align-GVGD, PolyPhen2 et SIFT nous ont servi pour estimer la pathogénicité des variants faux-sens rares susceptibles d'être délétères. Ces trois outils de prédiction sont basés sur la conservation des protéines au cours de l’évolution. On sait qu’en général plus une protéine, ou un domaine protéique, est conservé au cours de l’évolution plus ses fonctions sont essentielles à la cellule. Partant de ce principe, s’il y a une mutation dans un domaine conservé il y a de forte probabilité qu’elle soit pathogène.
Align GVGD est un outil de prédiction basé sur le modèle mathématique de Grantham qui permet de calculer la distance entre deux acides aminés positionnés dans un plan en fonction de leur composition, de leur polarité et de leur volume (Figure 11). La première étape pour l’utilisation de ce programme a été d’aligner la séquence protéique d’Abraxas provenant de différentes espèces allant de l’Homo sapiens à la Xenopus laevis. Ensuite, pour une position donnée, l’acide aminé de chaque espèce sauf celui de l’Homme est positionné dans le plan de Grantham. On trace alors un cube englobant chaque acide aminé et on calcule la Variation de Grantham (GV) qui correspond à la distance entre les coins opposés du cube (Figure 11).
Figure 12 : Positionnement des acides aminés dans le plan de Grantham.
Dans le plan l’axe C représente la composition, l’axe V le volume et l’axe P la polarité de l’acide aminé.
Puis, dans le même plan, on place l’acide aminé présent dans la séquence de l’Homme à la position d’intérêt et on calcule la Déviation de Grantham (GD) qui est égale à la distance entre l’arête la plus proche du cube et la position de l’acide aminé de l’Homme (Figure 12).
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Figure 13 : Calcul du GD et du GV
Le rapport GV/GD nous donne une évaluation de l’impact de la variation sur la protéine selon une échelle de risque définie de C0, classe de risque la plus faible, à C65 classe de risque la plus forte (Figure 13) en passant par cinq classes intermédiaires : C15, C25, C35, C45 et C55. Replaçons maintenant ce modèle mathématique dans le contexte de conservation des protéines au cours de l’évolution : si à une position donnée l’acide aminé est conservé chez toutes les espèces utilisées pour l’alignement il n’y aura pas de cube formé dans le plan de Grantham mais uniquement un point, donc GV=0. Si l’acide aminé dans la séquence humaine est le même que pour les autres espèces, alors sa position dans le plan dans Grantham sera la même que celle des autres espèces, et donc GD=0. D’après l’échelle de risque GV/GD=0 correspond à la classe de risque C0, et donc en toute logique l’impact sur la protéine est nul puisque l’acide aminé est conservé. En revanche, si l’acide aminé présent chez l’Homme diffère, le GD variera selon la composition, le volume et la polarité de cet acide aminé. Plus ces trois variables changent plus le GD augmente, et par conséquent la classe de risque aussi. Donc l’impact du variant sur la protéine est de plus en plus pathogène à mesure que les variables diffèrent de l’acide aminé conservé chez les autres espèces.
Pour SIFT j’ai également utilisé l’alignement protéique réalisé pour AlignGVGD. La différence entre ces deux outils de prédiction étant la manière de calculer l’impact du variant sur la protéine et la façon de les classer. En effet, SIFT calcule des probabilités normalisées pour toutes les substitutions possibles à chaque position. Le variant est classé « délétère » si la probabilité est ≤0,05 et « toléré » si la probabilité est 0,05. En ce qui concerne le troisième outil de prédiction, PolyPhen2, l’alignement utilisé est celui proposé par le serveur et les variants sont classés comme « bénin », « possiblement dommageable » et « Probablement dommageable ».
Figure 14 : Echelle de risque du modèle AlignGVGD.
L’échelle est comprise entre C0 (risque le plus faible) et C65 risque le plus élevé, en passant par les risques intermédiaires C15, C25, C35, C45 et C55.
Cette approche devait conduire à l'identification de variants relativement rares qui représentent une catégorie importante de variants à étudier dans le contexte d'une prédisposition génétique car ces variants sont plus susceptibles d'être des variants causals.
Bien que mon projet était la caractérisation des variants rares de la séquence codante d’Abraxas, j’ai approfondie l’étude de certains d’entre eux par des essais fonctionnels.
Pour 2 variants classés dommageables pour la protéine par les outils in silico, j’ai voulu vérifier les prédictions en évaluant leur impact au niveau cellulaire. Nous savons qu’Abraxas joue un rôle central dans la réparation des cassures doubles-brins de l’ADN, donc pour tester l’hypothèse que les variants ont réellement un impact sur la protéine et peuvent influencer la localisation d’Abraxas aux sites de cassures, le laboratoire du Dr Jean-Yves Masson a réalisé des essais d’immunofluorescence. Le but de ces essais est d’induire des cassures doubles-brins à l’ADN par un agent chimique, l’hydroxy-urée, et de regarder si Abraxas est toujours recrutée aux sites de cassures. Les cellules MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) que nous avons utilisées ont d’abord été « knockées » pour le gène
Abraxas via un shRNA pour que la protéine endogène n’influent pas les résultats observés. Nous avons sélectionné
les cellules qui présentaient un « knock-down » de 85% pour les transfecter avec un vecteur contenant le cDNA complet d’Abraxas et une séquence HA-Flag qui peut être reconnue spécifiquement par un anticorps anti-HA. Les cellules transfectées expriment donc la protéine majoritairement de façon exogène. Grâce à leur séquence HA-Flag nous pouvons marquer ces protéines par un anticorps primaire anti-HA, puis localiser la protéine via un anticorps secondaire anti-anticorps primaire couplé à un fluorochrome. Pour pouvoir observer la localisation d’Abraxas aux sites de cassures doubles-brins de l’ADN, les histones g-H2AX, qui sont un marqueur des sites de cassures, sont
28 révélés en rouges par la même technique que pour Abraxas (Figure 3 de l’article), et Abraxas est marquée en vert. Le DAPI colore le noyaux de façon à vérifier que les protéines sont bien retrouvées dans le noyaux.
J’ai également voulu vérifié si l’un des variant situé au début de l’exon 1 pouvait influencer l’épissage alternatif de l’intron 1. Pour cela j’ai utilisé la technique du mini-gène qui consiste à insérer dans le vecteur pcDNA3.1 les exons et une cinquantaine de paires de bases de l’intron d’intérêt. Le vecteur pcDNA3.1 (Figure Annexe 2) possède un promoteur T7 qui permet d’initier la transcription et une séquence spécifique qui est transcrite en même temps que les exons. Une fois le vecteur construit il a été transfecté dans les cellules HEK293T. Le but est d’ensuite extraire l’ARN total des cellules puis de faire une RT-PCR dirigée sur notre transcrit exogène grâce à la séquence spécifique du vecteur. Enfin, on dépose le produit PCR sur gel pour observer la taille des transcrits en présence ou non du variant d’intérêt.
Ce projet représentait donc une source de variants additionnels, en plus des variants communs et variants fonctionnels de régulation de l’expression génique, à être évalués pour une association avec le cancer du sein dans la population générale.
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1. Résumé de l’article
Environ 35% du risque familial de cancer du sein est expliqué par les allèles de susceptibilité actuellement connus, il reste donc 65% de l’héritabilité inexpliquée ce qui suggère qu’il existe d’autres gènes de susceptibilité à découvrir. Les cassures doubles brins de l’ADN sont l’évènement causant le plus de dommages aux cellules car elles mettent en péril la stabilité et l’intégrité du génome. La majorité des gènes de susceptibilité au cancer du sein déjà identifiés, incluant BRCA1, BRCA2, CHEK2, ATM, BRIP1 et PALB2 sont impliqués dans les voies de réparation des cassures doubles brins de l’ADN. Abraxas est un membre du complexe A qui achemine BRCA1 aux sites de dommages à l’ADN lors de la réparation par recombinaison homologue. Des évidences montrent que des mutations dans la séquence protéique d’Abraxas empêchent le recrutement de BRCA1 aux sites de cassures et augmentent la sensibilité des cellules aux radiations ionisantes. De plus Abraxas a déjà été identifié comme gène de susceptibilité au cancer du sein dans des familles finlandaises à haut risque de cancer du sein. Pour déterminer si Abraxas peut être un gène de susceptibilité à pénétrance intermédiaire, nous avons postulé que des mutations germinales dans ce gène pourraient augmenter le risque de développer un cancer du sein.
Les neufs exons codants d’Abraxas ont été analysés par « High Resolution Melting Curve » chez 1330 cas de cancer du sein précoces et chez 1123 témoins provenant de l’étude du Breast Cancer Family Registry. Seize variants rares on été identifiés : 9 d’entre eux sont non-synonymes, 4 synonymes et 3 introniques. L’impact des substitutions non- synonymes sur la protéine a été évalué par analyses in silico, et deux d’entre elles ont été classées avec les plus hauts grades de dommages. En dépit de ces résultats, notre étude ne nous permet pas d’associer ces variants avec le risque de cancer du sein.
Notre étude suggère que les mutations rares localisées dans le gène Abraxas n’ont pas d’impact sur la susceptibilité au cancer du sein dans l’étude du Breast Cancer Family Registry.
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2. Article
L’article actuellement en cours de corrections par les différents collaborateurs sera soumis dans le journal PlosOne
Abraxas (FAM175A) and breast cancer susceptibility: no evidence of association in the Breast Cancer Family Registry
Anne-Laure Renault1, Fabienne Lesueur2, Penny Soucy1, Yosr Hamdi1, Yan Coulombe3, Stéphane
Gobeil4, Florence Le Calvez-Kelm5, Maxime Vallée5, The Breast Cancer Family Registry6,7,8,9,10, John L.
Hopper6, Irene L. Andrulis7, Melissa C. Southey8, Esther M. John9,10, Jean-Yves Masson3, Sean V.
Tavtigian11, Jacques Simard1
1Cancer Genomics Laboratory, CHUQ Research Center, Quebec City, Canada, 2INSERM, U900, Mines