La complémentarité des protéines de transports (MCT, NHE1, NBCe1) (Figure 14)

a) Leur localisation.

MonoCarboxylates Transpoters (MCT).

Dans différents tissus, dont le muscle est le principal concerné, le transport actif de molécules riches en énergie telles que le lactate et le pyruvate, ainsi que d’autres acides mono-carboxyliques, est assuré par différents isoformes de MCT (Monocarboxylate Transporters). Chez les mammifères au moins 14 isoformes ont d’ores et déjà été trouvées (Halestrap & Meredith, 2004). Dans le muscle strié squelettique, les isoformes 1, 2et 4 sont les principales représentantes des MCTs, et assurent donc la plus grande partie du transport de lactate et d’ions H+ de façon bidirectionnelle (i.e. milieu cellulaire vers milieu extracellulaire ou vis-versa) et ceci sans consommation d’énergie.

Pour rappel, les MCT peuvent être révélés par la technique du Western Blot (que nous détaillerons ultérieurement), et apparaissent chez l’homme à un poids moléculaire de 45 kDa.

Les MCT1.

Cette isoforme a été identifiée dans l’ensemble des muscles squelettiques humains et, du fait de la présence d’un promoteur universel au sein de son gène, semble être ubiquitaire. (Pilegaard et al., 1999b) mettaient en évidence par immunofluorescence la présence de MCT1 principalement au sein des fibres de type I (r= 0.66 ; P<0.01), ainsi qu’une corrélation négative entre le pourcentage de fibres musculaires de type IIx d’un muscle et l’expression protéique de MCT 1 (r= -0.73 ; P<0.01). Ainsi, il apparait qu’un muscle composé uniquement de fibres de type IIa et IIx ne présentera seulement 40% du contenu en MCT 1 d’un muscle purement oxydatif.

Les MCT4.

Cette isoforme, relativement proche de MCT1 (43% d’homologie séquentielle), a été détectée à la fois dans le rein, le placenta et dans tous les muscles striés squelettiques analysés par (Pilegaard et al., 1999b) (vaste externe, triceps brachial et soléaire). Cependant, sa distribution est substantiellement différente de celle de MCT1. En effet, dans le muscle humain la densité en MCT4 est indépendante du type de fibres et est, de plus, sujette à une

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grande variabilité interindividuelle (Pilegaard et al., 1999b). Cette distribution s’oppose à celle observée dans le muscle de rat où MCT4 apparaît positivement corrélé avec les fibres musculaires glycolitiques (Wilson et al., 1998; Juel & Halestrap, 1999).

Localisations intracellulaire des MCT1 et MCT4

Si l’on s’intéresse maintenant à la localisation cellulaire, (Bonen, 2000) démontrent, qu’indépendamment du type de muscle, la plus forte concentration en MCT1 et MCT4 se situe au niveau de la membrane plasmique. Ensuite, les auteurs ont pu normaliser la concentration de ces deux isoformes au sein de la cellule musculaire selon les concentrations plasmiques. Ainsi, il apparait que MCT4 est plus concentré que MCT1 dans les tubules-T (35

vs 14%), au niveau du réticulum sarcoplasmique (43 vs 15%) et au niveau des triades (66.5 vs

32%). De plus, alors qu’une quantité négligeable de MCT1 (1.7%) est présente au niveau des membranes intracellulaires, la présence de MCT4 est beaucoup plus prononcée (24%).

Il semble intéressant de noter les similitudes apparentes entre les MCTs et une autre famille de protéines transmembranaires que sont les GLUT. Ces transporteurs en charge du transport du glucose se divisent aussi en deux isoformes principales que sont GLUT1 et GLUT4. La première isoforme se retrouve majoritairement dans la membrane plasmique, alors que l’isoforme GLUT4 est majoritairement présente dans le pool intracellulaire (Thorens & Mueckler, 2010) les tubules T et les triades (Roy et al., 1997). Si l’on fait le parallèle avec les isoformes de MCT1 et 4, on s’aperçoit que seule l’isoforme MCT4 est présente dans le pool intracellulaire, ce qui soulignerait une différence fonctionnelle entre MCT1 et MCT4. En effet, à l’image de GLUT4, (Bonen, 2000) avancent l’hypothèse d’un recrutement du pool intracellulaire de MCT4 afin de faciliter l’extrusion du lactate lors d’exercices musculaire. Toutefois, cette hypothèse n’a toujours pas été vérifiée.

Les NHE.

Les NHE (pour « sodium proton exchanger » ou « Na+/H+ exchanger ») forment une grande famille de protéines de transport ubiquitaires, situées uniquement sur les parois membranaires (Kemp et al., 2008), que l’on retrouve dans tous les organismes vivants (bactéries, plantes, mammifères…). La protéine est détectable par Western Blots à hauteur d’un poids moléculaire de 100 kDa. Ce système d’échange Na+/H+ a pour la première fois été mis en évidence en 1977 par (Aickin & Thomas, 1977), comme étant un système de

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régulation du pHi. Depuis, neuf isoformes de NHE ont été découvertes chez l’homme. Les

isoformes NHE1 et NHE2 sont présentes dans le muscle strié squelettique et semblent être activées lorsque le pHi atteint de faibles valeurs. NHE3 se retrouve principalement dans les

parois intestinales et le rein (Amemiya et al., 1995), NHE4 dans l’estomac et le rein (Orlowski et al., 1992), NHE5 se situe spécifiquement dans le cerveau (Baird et al., 1999). Enfin les isoformes 6 à 9, qui sont de loin les moins connues, semblent être localisées dans les compartiments intracellulaires pour y moduler très finement le pH (Nakamura et al., 2005).

Les NBC.

Les co-transporteurs sodium/bicarbonate (Na+/HCO3-) ont été classifiés en quatre

isoformes distincts par (Soleimani & Burnham, 2001). Seules les isoformes NBCe1 et NBC4 ont pu être détectés, au niveau protéique (150 kDa et 200 kDa respectivement), dans le muscle strié squelettique humain (Kristensen et al., 2004a). L’isoforme NBC3 a quant-à elle été identifiée au niveau de l’ARNmt dans le cœur et le tissu musculaire humain (Pushkin et al.,

1999).

Contrairement au muscle de rat où le contenu en NBCe1 était uniformément réparti entre les muscles rapides et lents, et NBC4 positivement corrélé avec la densité en fibres musculaires oxydatives ; chez l’homme ces deux isoformes sont négativement corrélées à la portion de fibres oxydatives. Il est toutefois important de noter ici aussi de grandes variations interindividuelles. Par ailleurs chez l’homme, l’analyse par immunohistochimie de muscles squelettiques révèle la présence de NBCe1 et 4 à la fois dans la membrane du sarcolemme et dans des structures intracellulaire (Tubules-T principalement) (Kristensen et al., 2004a).

L’essentiel :

►MCT1, 2 et 4 sont les plus présentes dans le muscle.

►MCT1 se retrouve plutôt dans les FM de type I, et l’expression des MCT4

semble affranchie du type de FM malgré une grande variabilité interindividuelle.

►MCT1/4, NHE1 et NBCe1 sont présentent sur la membrane cellulaire, de

plus MCT4 et NBCe1 formeraient aussi un pool intracellulaire.

78

b) Leur fonction et mécanismes de fonctionnement

Le pHi dans les muscles squelettiques est régulé par l’activité coordonnée de plusieurs

transporteurs. Dans le muscle au repos, la production cellulaire de protons ainsi que le potentiel de membrane négatif permettent l’accumulation d’ions H+ à l’intérieur même de la cellule. Toutefois, cette tendance à l’accumulation peut être compensée par un système de transporteurs intra-membranaires, comme ceux présentés précédemment, permettant le maintien de l’homéostasie.

Alors que les contractions musculaires sont associées à une augmentation importante de lactate et d’ions H+ notamment, les exercices de haute intensité nécessitent une élimination efficace de ces produits soit par les différents systèmes de transports soit par la capacité tampon (détaillée ensuite, (Edge et al., 2006b; Bishop et al., 2009)). Ainsi, la majeure partie de ces efflux est assurée par les MCTs (Juel et al., 1994; Juel, 1996a, 1997; Messonnier et al., 2007; Thomas et al., 2012). En effet, pendant l’exercice, l’élimination du couple lactate/H+ par les MCTs excède la somme de l’élimination des protons par l’échangeur Na+/H+ et le système bicarbonate-dépendant (Juel, 1995, 1997; Pilegaard & Juel, 1995). Les MCTs sont responsables de la diffusion couplée et facilitée d’un lactate pour un proton (1 :1) (Juel, 1996a), dans le sens du gradient de concentration. L’élimination des protons est aussi complétée par les échangeurs Na+/H+, qui sont cependant plus actifs au repos qu’à l’exercice (Aickin & Thomas, 1977; Juel, 1998, 2000; Mohr et al., 2007), ainsi que part des systèmes impliquant le bicarbonate tels que les NBCe1 (Kristensen et al., 2004a).

De plus, il a été mis en évidence que l’action combinée de certaines protéines permettait d’augmenter la capacité de régulation du pH, comme par exemple la CAII et IV

(pour « Carbonic anhydrase isoform II/IV») (Becker et al., 2011; Klier et al., 2014) et NBCe1

quand associées à MCT1 (Becker et al., 2004). Enfin, il a été démontré que les MCTs doivent

être correctement localisés sur la membrane cellulaire par l’action de leur protéine chaperonne

CD147 (ou Basignin / EMMPRIN) afin d’être pleinement efficaces (Kirk et al., 2000; Wilson

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Figure 14 : Présentation récapitulative de la régulation de lactate et de protons (D’après Thomas ((Thomas et al., 2012)).

Carbonic Anhydrase (CA) represent cytosolic (cCA) and membrane-bound (sCA) CA isoforms. NBCe1: Sodium-Bicarbonate Co-transporter. NHE: Na+-H+ Exchanger. MCTs: MonoCarboxylate Transporters (lactate-proton co-transporter). GLUTs: Glucose Transporters. CD147: Cluster of Differentiation 147. PGAL: Phosphoglyceraldehyde. DHAP : Dihydroxyacetonephosphate. LDH: Lactate Dehydrogenase. Valeurs de pH au repos dans le plasma, le milieu interstitiel et le muscle squelettique.

Fonctionnement des MCTs et regulation du pH

Tout d’abord, il est important de noter la forte affinité des MCT 1 pour le lactate (Km compris entre 3.5 et 8.3mM ;(Lin et al., 1998; Broer et al., 1999; Dimmer et al., 2000), ce qui lui confère un rôle important de captage dans les muscles oxydatifs, et donc dans l’ensemble du métabolisme oxydatif. A l’inverse, l’affinité de MCT4 pour le lactate est sensiblement plus faible que celle de MCT1 avec un Km compris entre 25 et 31 mM (Broer et al., 1999; Dimmer et al., 2000). Il semblerait donc qu’avec une faible affinité mais une grande capacité de transport, MCT4 joue principalement un rôle dans l’extrusion du lactate (Wilson et al., 1998).

Ces co-transporteurs jouent donc un rôle important dans la régulation du pH intramusculaire pendant l’exercice de haute-intensité en permettant l’échange d’un proton

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pour un lactate (Pilegaard et al., 1999a; Juel & Halestrap, 1999), et ce en fonction de l’importance des gradients de concentration et du pH (Juel, 1996a, 1996b). Les MCTs étant bidirectionnels, cela signifie qu’ils peuvent faciliter les flux de lactate et d’ions H+ à la fois vers l’intérieur du muscle ou vers l’extérieur (Juel, 1991, 1997; McDermott & Bonen, 1994; Brown & Brooks, 1994). Ce principe de navette du lactate de cellule à cellule (« cell-to-cell lactate shuttle) (Brooks, 2000) fournit la toile de fond quant à la compréhension du métabolisme et des échanges du lactate. Ainsi, le rôle primordial des MCTs dans l’augmentation de la capacité des tissus à échanger du lactate est souligné. Sans ces co- transporteurs, le lactate (en parallèle du transport des ions H+) ne pourrait pas être rapidement mis à disposition pour d’autres tissus tels que le foie, le cerveau et d’autres fibres musculaires proches (Dimmer et al., 2000; Halestrap & Meredith, 2004; Burgomaster et al., 2007), et l’acidification du milieu interstitiel (par accumulation d’ions H+) et du sang serait beaucoup moins contrôlé.

Bien que le ratio entre le lactate produit et le lactate éliminé varie selon les études, un consensus est maintenant établi sur l’élimination importante d’ions H+ et de lactate à la fois pendant et après l’exercice. Ainsi, même lors d’exercices brefs et intenses, approximativement 1/3 de la quantité totale de lactate et de protons produits est éliminé à l’exercice alors que la fraction restante est éliminée lors de la récupération afin de revenir à un pH physiologique neutre (Juel et al., 1990; Bangsbo et al., 1993). De cette façon l’existence des MCTs, va à la fois permettre de réduire l’accumulation de lactate et de H+ pendant toute la durée de l’exercice, mais aussi de diminuer la phase de retour à l’homéostasie.

Comme le transport facilité de lactate s’accompagne forcément d’un proton, chaque changement de flux ou de concentration en lactate va entraîner une modification de pH. Ainsi, il est acquis que dans le muscle squelettique les variations de pH sont définies par le rapport entre la quantité d’ions H+ produite et celle éliminée, et que cette balance est grandement liée aux transporteurs membranaires (Pilegaard & Juel, 1995; Juel & Pilegaard, 1998). L’importance des MCTs pour ce mode de fonctionnement, a été soulignée chez le rat par leur capacité supérieure à assurer le transport de H+ à l’exercice, par rapport aux systèmes d’échange sodium dépendants (NHE) (Juel, 1995).

Fonctionnement des NHEs et regulation du pH

Bien que peu étudiées, les premiers travaux portant sur ces protéines se sont attachés à déterminer la topologie membranaire de l’isofomre NHE1 afin de pouvoir en comprendre les

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mécanismes d’activation et d’inhibition (Kemp et al., 2008). Aussi, il a été mis en évidence que sa structure lui permettait de faire passer des molécules hydrophiles à travers la membrane plasmique hydrophobe (Kyte & Doolittle, 1982). Enfin, lié à leur conformation spatiale bien que leurs séquençages génomiques varient (25 à 65%), l’ensemble des isoformes de la famille des NHEs ont des propriétés proches.

Ainsi chez l’homme, la fonction physiologique la plus importante est de permettre la sortie des protons intracellulaire en échange de sodium (Na+) ou de lithium extracellulaire (ratio de 1:1). Du fait de sa fonction de base qu’est la régulation du pH, l’isoforme 1 influe sur une multitude de tâches spécifiques comme la croissance cellulaire, la prolifération cellulaire, la migration cellulaire et enfin l’apoptose.

Fonctionnement des NBCs et régulation du pH

.

A ce jour, les mécanismes par lesquels le contenu en NBCe1 est régulé dans le muscle strié squelettique ne sont toujours pas connus. Cependant, les deux isoformes clairement identifiées dans le muscle squelettique semblent être électrogéniques avec un ratio de 2:1 à 3:1 (HCO3- : Na+) (Soleimani & Burnham, 2001; Virkki et al., 2002) et donc transportent une

charge nette négative. Cette électrogénéité permet aux NBCs d’être sensibles aux changements de potentiels de membrane, ce qui est non sans importance pour l’activation de ces transporteurs à l’exercice, du fait de la dépolarisation sarcolemmale. De plus, à l’épuisement la concentration extracellulaire de K+ (potassium) peut doubler, ce qui va entraîner une dépolarisation encore plus marquée de la membrane d’environ 20 mV (d’environ -70 mV to -50 mV) (Juel, 1986; McKenna et al., 2008). Une telle diminution de gradient électrochimique au sein du muscle peut ainsi être un stimulus supplémentaire dans l’augmentation de l’activité des co-transporteurs Na+/HCO3- à l’exercice, en effet les

nécessités de régulation du pH seront bien plus importantes qu’au repos.

Pour conclure sur l’interaction de ces différents transporteurs membranaires, nous pouvons dire que les systèmes n’impliquant pas le lactate sont plus aptes à ajuster finement le pH ainsi que réguler le pH au repos, lorsque le gradient de lactate est faible ou absent, alors que durant l’exercice intense lorsque la production de lactate devient très importante, les MCTs seront beaucoup plus efficaces pour s’occuper des ions H+ produits.

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L’essentiel :

►NHE1 est principalement actif au repos alors que les MCTs et NBCe1 le sont

bien plus à l’exercice.

►Certaines protéines peuvent augmenter la capacité de régulations des protéines

de transport.

►L’affinité au lactate des MCT1 est bien plus importante que celle des MCT4. ►Les MCTs, NHE1 et NBCe1 permettent, ensemble, un échange bidirectionnel

du lactate, des protons et du bicarbonate.

►Leur degré d’activité est médiée par les gradients de concentrations en ions

H+, lactate et HCO3- principalement, de même que par les variations de pH intra et extracellulaire.

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c) Leur régulation par l’exercice aigu

Du fait qu’un certain nombre d’études ont été menées sur le sujet, il est maintenant connu que l’exercice aigu induit des modifications de gradient de lactate et d’ions H+ de part et d’autre de la membrane plasmique, changements régulés par l’action coordonnée de plusieurs protéines dont les MCTs, NHE1 et NBCe1. Toutefois, il n’est pas encore établi de façon certaine la relation qui semble exister entre l’intensité d’exercice et l’évolution des capacités de transport transmembranaire. De plus, parmi les études traitant de la question, peu ont été conduites sur du muscle strié squelettique humain.

MCT1 et MCT4:

Malgré le peu de travaux traitant de la régulation du contenu en MCTs, il semble qu’à la fois les isoformes 1 et 4 appartiennent à une catégorie de protéines qui peuvent rapidement être affectées par l’exercice aigu. Il a ainsi été rapporté qu’un exercice de 5 à 6 h de pédalage à 60% de VO2max augmentait temporairement (pendant 6 jours) le contenu en MCTs chez une

population d’hommes non-entraînés (Green et al., 2002). De la même manière, (Green et al., 2008) ont mis en évidence que 6 min d’exercice à 90% de VO2max réalisés toutes les heures

pendant 16 h, chez des sujets non-entraînés, permettaient une augmentation rapide en MCT4 (+24%), sans changements observés pour MCT1. A l’inverse, deux heurs de pédalage à 110% de la vitesse minimale à laquelle VO2max est atteint (vVO2max) chez des sujets moyennement

entraînés, a mis en avant une augmentation de MCT1 et pas de modification pour MCT4 (Bickham et al., 2006). Plus récemment, chez des femmes non-entraînées, il a été noté une diminution significative du contenu protéique des MCT1 (-24%) et MCT4 (-26%) immédiatement après un exercice de 45 sec à 200% de VO2max (Bishop et al., 2007 p.2007).

Ces données correspondent aux résultats de (Tonouchi et al., 2002) obtenus chez le rat après 10 min de stimulation électrique (MCT1 : -10% ; MCT4 : -25%). Il est possible d’expliquer les différences observées dans les études précitées par plusieurs facteurs tels que le type d’exercice (durée, intensité, intermittent vs continu) et le type de sujets (sexe, niveau d’entraînement, homme vs rats).

Si nous nous intéressons maintenant au timing séparant le début d’exercice et les biopsies permettant l’analyse musculaire, nous pouvons voir (Figure 15) une rapide diminution en MCT1 et MCT4 (-20 à -25%) entre 45 sec (Bishop et al., 2007) et 10 min (Tonouchi et al., 2002), suivi d’un plateau entre la 30ème et la 80ème minute (Eydoux et al., 2000b, 2000a), et enfin une augmentation des deux isoformes 2 h après le début de l’exercice (Coles et al.,

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2004; Bickham et al., 2006). Par ailleurs, le contenu en MCT1 reste à un niveau élevé 7, 12 et 26 h après le début de l’exercice à la fois dans le red gastrocnemius, le white gastrocnemius et le soleus de rats (Coles et al., 2004). De plus, à l’inverse de ce qui a pu être vu chez l’Homme (Bickham et al., 2006), dans cette étude le contenu en MCT4 a augmenté 2 h après le début de l’exercice, avec un pic apparent à 12 h et une forte concentration protéique toujours enregistrée 26 h plus tard (Coles et al., 2004). Ainsi, il semble qu’après une rapide et faible diminution, le contenu en MCTs chez le rat augmente dans les 5 à 24 h suivant le départ d’un exercice.

Figure 15 : Les cinétiques des contenus en MCTs lors de la récupération après un exercice, mais est pris en compte le temps depuis le début de l’exercice jusqu’à ce que la biopsie soit réalisée. (D’après Thomas (Thomas et al., 2012), avec les données de Bishop (Bishop et al., 2007), Tonouchi (Tonouchi et al., 2002), Eydoux (Eydoux et al., 2000b, 2000a), Bickam (Bickham et al., 2006) et Coles (Coles et al., 2004)).

Concernant NHE1 et NBCe1, aucune étude ne semble avoir porté sur les effets d’un exercice aigu sur leur régulation. Toutefois, il a été reporté une corrélation positive entre le contenu relatif en MCT1 et NBCe1 (r = 0.50, P<0.01) dans des muscles oxydatifs de rat après 5 semaines d’entraînement à haute-intensité (Thomas et al., 2007). Ce résultat peut alors laisser penser que NBCe1 a été régulé de la même manière que MCT1 par l’exercice. Enfin, il est important de souligné le rôle que joue la CAII dans la régulation de toutes ces protéines de transports (présente dans le compartiment intra- et extracellulaire). En effet, il a été mis en évidence, seulement de façon in vitro, qu’en se liant aux protéines telles que NHE1 (Li 2002, 2006), NBCe1 (Pushkin et al., 2004; Becker & Deitmer, 2007; Schueler et al., 2011), MCT1 et MCT4 (Becker et al., 2005, 2010, 2011; Becker & Deitmer, 2008; Almquist et al., 2010;

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Stridh et al., 2012), la CAII augmentait l’activité de tous ces transporteurs membranaires. (Becker et al., 2010, 2011), émettent l’hypothèse selon laquelle cette augmentation d’activité pourrait être due à une dissipation des protons intracellulaires via une navette intramoléculaire, en d’autres termes cela augmenterait l’affinité des deux isoformes de MCTs (Deitmer & Becker, 2013). Pour illustrer cela, il a été montré chez l’homme que l’inhibition de la CAII extra- et intracellulaire était associée avec une concentration plasmatique en lactate plus faible au cours d’un exercice incrémental, certainement dû à une moindre élimination du lactate musculaire par les MCTs.

d) Possibles mécanismes impliqués dans la régulation

Les diminutions de concentration en MCTs (isoformes 1 et 4), immédiatement après l’exercice, précédemment reportées (Tonouchi et al., 2002; Bishop et al., 2007) peuvent être dues à différents facteurs nécessitant leur pleine compréhension, parmi lesquels nous pouvons citer : 1/ la peroxydation lipidique qui peut entraîner la perméabilité membranaire et donc des fuites de protéines (Davies et al., 1982), 2/ la translocation intracellulaire ainsi que 3/ l’oxydation de protéines amenant à des disfonctionnements au niveau des transporteurs (Barreiro & Hussain, 2010). Une autre hypothèse, émise par (Tonouchi et al., 2002) concerne la translocation des transporteurs vers un pool intracellulaire. Ces pools ont déjà pu être observés dans des cardio-myocytes de rat après hypertrophie (Johannsson et al., 2001) mais les mêmes résultats nécessitent d’être validés dans le muscle strié squelettique humain.

En parallèle des hypothèses précédentes, il est vraisemblable qu’une synthèse protéique a lieu, ce qui expliquerait les variations de concentrations notées sur la Figure 15 où l’on observe, après une baisse initiale, un plateau puis une augmentation dans le contenu en MCTs. De plus, bien qu’une seule étude l’ait montré chez l’homme, il apparaît qu’un exercice de temps limite réalisé à 110 % de vVO2max entraînant 2 h plus tard une augmentation en

MCT1 au niveau protéique, ne s’accompagne pas d’une augmentation en ARNm (Bickham et

al., 2006). Ceci suggérerait que l’expression en MCTs peut être régulée en premier lieu par

des mécanismes post-transcriptionnels, ou par une combinaison de ces mécanismes avec une