Comparaison quantitative des méthodes rapides

La méthode originale a été effectuée en LC conventionnelle (Fig. 14) avec un temps d’analyse de 10 min environ.

Figure 14 : Séparation d’une formulation de Rapidocaïne^® reconstituée (RDF100%) contenant : (1) méthylparabène, (2) 2,6-diméthylaniline, (3) propylparabène, (4) lidocaïne HCl. Colonne : XTerra RP18 (150 x 4.6 mm, 5 µm) ; Système LC : conventionnel ; Volume d’injection 10 µL ; Phase mobile : acétonitrile – tampon phosphate pH 7.4 (40 :60 v/v), Débit : 1 mL/min, Détection : UV@230 nm, 100 ms, 20 Hz.

La méthode a été transférée, puis optimisée en fonction de la particularité de chaque technique (e.g.

pH, pourcentage de solvant organique, débit, fréquence d’acquisition, etc.), tout en maintenant des résolutions chromatographiques acceptables dans chaque cas. Afin de mieux comprendre la particularité de chaque approche, les courbes de Knox (Fig. 15) et de pression (Fig. 16) ont été tracées.

Le gain en efficacité, par rapport à la LC conventionnelle (particules de 5 µm), est de 20% pour les monolithes et la HTLC utilisant des particules de 5 µm, tandis que pour les deux supports sub-2 µm, le gain est de 50 à 60%. Les vitesses linéaires optimales (u_opt), par rapport à la LC conventionnelle, sont déplacées vers des valeurs plus élevées, particulièrement pour la HTLC et les supports sub-2 µm.

Figure 15 : Comparaison des courbes de Knox pour différentes approches LC. = colonne LC conventionnelle XTerra RP18

150 x 4.6 mm, 5 µm ; = colonne monolithique Chromolith C18 100 x 4.6 mm; = colonne HTLC Zorbax Stable Bond C18

150x4.6 mm, 5 µm, temperature : 90°C, = colonne Hypersil GOLD C18 50 x 2.1 mm, 1.9 µm, pression maximale 400 bars ;

= colonne UPLC Acquity Shield BEH RP18 50 x 2.1 mm, 1.7 µm, pression maximale 1000 bars.

Cependant, les supports sub-2 µm présentent une perte de charge (Fig. 16) importante liée à la réduction de la taille des particules (loi de Darcy (Eq.(3)) [31]. Parmi les techniques rapides, les monolithes et la HTLC affichent les valeurs les plus faibles en terme de perte de charge. Les monolithes bénéficient d’une grande perméabilité liée à leur structure bimodale (i.e. macropores et mésopores) [10]. Pour la HTLC, la viscosité de la phase mobile diminue avec la température expliquant la faible perte de charge générée [13].

Figure 16 : Comparaison de la perte de charge en fonction de la vitesse réduite pour différentes approches LC. = colonne LC conventionnelle XTerra RP18 (150 x 4.6 mm, 5 µm) ; = colonne monolithique Chromolith C18 (100 x 4.6 mm); = colonne HTLC Zorbax Stable Bond C18 (150x4.6 mm, 5 µm), température : 90°C, = colonne Hypersil GOLD C18 (50 x 2.1 mm, 1.9 µm), pression maximale 400 bars ; = colonne UPLC Acquity Shield BEH RP18 (50 x 2.1 mm, 1.7 µm), pression maximale 1000 bars.

Alors que la méthode originale a été effectuée à un débit de phase mobile de 1 mL/min avec un temps d’analyse de 8.5 min, le débit utilisé pour la colonne monolithique a été ajusté à 5 mL/min afin de réduire les temps d’analyse (1.4 min) tout en gardant une efficacité comparable à la méthode originale (flèches 1 et 2 Fig. 15). Pour la HTLC à 90°C, le d ébit utilisé a pu être augmenté à 4 mL/min (flèche 3 Fig. 15) permettant une séparation en 2.3 min. Quant aux colonnes de 2.1 mm d.i. remplies de

particules sub-2 µm, le débit générant la pression maximale supportée par la colonne a été utilisé, soit 600 µL/min pour la colonne résistant à 400 bars (flèche 4 Fig. 15) et 1000 µL/min pour la colonne UPLC (flèche 5 Fig.15), ceci avec des efficacités supérieures à la méthode originale et avec des temps d’analyse de 1.35 et 0.75 min, respectivement. Le pH des solutions tampon et la proportion de solvant organique (acétonitrile) ont été adaptés selon les colonnes utilisées afin d’obtenir des résolutions suffisantes dans chaque cas. Les chromatogrammes générés avec la colonne monolithique (Fig 17a), la HTLC (Fig. 17b), le support sub-2 µm résistant à 400 bars (Fig. 17c) et le support sub-2 µm résistant à 1000 bars (Fig.17d) sont présentés ci-dessous :

Figure 17 : Séparation d’une formulation de Rapidocaïne^® reconstituée (RDF100%) contenant : (1) méthylparabène, (2) 2,6-diméthylaniline, (3) propylparabène, (4) lidocaïne HCl. (a) Colonne : = colonne monolithique Chromolith C18 (100 x 4.6 mm);

Système LC : conventionnel ; Volume d’injection 10 µL ; Phase mobile : acétonitrile – tampon phosphate pH 6.0 (32 :68 v/v), Débit : 5 mL/min, Détection : UV@230 nm, 100 ms, 20 Hz, Température : 30°C. (b) Colonne : = HTLC Zorb ax Stable Bond C18

(150x4.6 mm, 5 µm); Système LC : conventionnel ; Volume d’injection 10 µL ; Phase mobile : acétonitrile – tampon phosphate pH 5.0 (31 :69 v/v), Débit : 4 mL/min, Détection : UV@230 nm, 100 ms, 20 Hz, Température : 90°C. (c) C olonne Hypersil GOLD C18 (50 x 2.1 mm, 1.9 µm), pression maximale 400 bars; Système LC : UPLC ; Volume d’injection 2 µL ; Phase mobile : acétonitrile – tampon phosphate pH 7.0 (40 :60 v/v), Débit : 600 µL/min, Détection : UV@230 nm, 25 ms, 40 Hz, Température : 30°C. (d) Colonne UPLC Acquity Shield BEH RP18 (50 x 2.1 mm, 1.7 µm), pression maximale 1000 bars; Système LC : UPLC ; Volume d’injection 2 µL ; Phase mobile : acétonitrile – tampon phosphate pH 7.2 (40 :60 v/v), Débit : 1000 µL/min, Détection : UV@230 nm, 25 ms, 40 Hz, Température : 30°C.

4.4.1. Spécificité - sélectivité

La spécificité-sélectivité de toutes les approches évaluées est jugée satisfaisante puisque les profils chromatographiques n’ont révélé aucune interférence entre la lidocaïne et les autres constituants de la formulation. Les résolutions minimales obtenues dans les conditions utilisées sont toujours comprises entre 3 et 6.

4.4.2. Fidélité

Les valeurs obtenues pour la répétabilité et la fidélité intermédiaire se trouvent dans les limites acceptables (Tableau 8). L’ensemble des méthodes est donc jugé acceptable d’un point de vue de l’erreur aléatoire.

Tableau 8 : Répétabilité et fidélité intermédiaire des diverses méthodes.

Concentration par

niveau Conven. Monolith HTLC Sub-2µm

400 bars UPLC

80% 0.8% 0.9% 0.6% 0.8% 0.7%

100% 1% 0.8% 1.2% 0.9% 1.2%

120% 0.7% 1.0% 0.7% 0.9% 0.8%

CV répétabilité

Valeurs acceptables pour la répétabilité : < 1%

80% 0.8% 1.2% 0.9% 0.9% 0.9%

100% 1% 1.7% 1.6% 0.9% 1.2%

120% 0.7% 1.1% 0.7% 0.9% 0.9%

CV fidélité intermédiaire

Valeurs acceptables pour la fidélité intermédiaire : < 2%

4.4.3. Justesse

Les valeurs de justesse, généralement exprimées en terme de recouvrement, doivent être comprises entre 98% et 102 % pour une formulation pharmaceutique. Dans les cinq méthodes testées, les valeurs de recouvrement sont satisfaisantes et se situent entre 99.2 et 101.3 %.

Tableau 9 : Justesse des diverses méthodes.

Concentration par

niveau Conv. Monolith HTLC Sub-2µm

400 bars UPLC

80% 100.1% 99.6% 101.3% 99.0% 100.4%

100% 99.2% 99.4% 100.7% 99.2% 99.5%

120% 99.7% 99.5% 100.7% 99.5% 100.0%

Justesse

Valeurs acceptables pour la justesse : 98 - 102%

4.4.4. Exactitude

L’exactitude, représentant la contribution de la fidélité et de la justesse d’une méthode, doit se trouver dans l’intervalle 95 – 105 % de la valeur cible pour une formulation pharmaceutique. Par soucis de clarté, l’exactitude est souvent présentée sous forme de profil d’exactitude (SFSTP 1997). Toutes les approches (Fig. 18a-e) utilisées présentent des performances inclues dans cet intervalle de confiance.

Figure 18 : Profils d’exactitude des diverses techniques. (a) Colonne conventionnelle XTerra RP18 (150 x 4.6, 5 µm) ; (b) Colonne monolithique Chromolith (100 x 4.6 mm) ; (c) Colonne HTLC Zorbax Stable Bond (150 x 4.6 mm, 5 µm) ; (d) Colonne Hypersil GOLD (50 x 2.1 mm, 1.9 µm) ; (e) Colonne UPLC Acquity Shield BEH (50 x 2.1 mm, 1.7 µm).

4.5. Discussion

Toutes les approches évaluées ont donné des résultats quantitatifs satisfaisants et comparables à la LC conventionnelle. Par conséquent, il est possible de réduire significativement le temps nécessaire à la validation. Un total de 140 min est nécessaire pour réaliser une journée de validation en LC conventionnelle, alors qu’en HTLC, monolithes et avec les supports sub-2 µm à haute pression, les temps d’analyse (en tenant compte du temps de cycle d’injection) sont réduits, respectivement, de 3, 4 et 8 fois. D’un point de vue qualitatif, le choix des supports sub-2 µm résistant à 1000 bars permet d’obtenir un grand nombre de plateaux théoriques avec un temps d’analyse raisonnable (e.g.

séparation de mélanges complexes) et de réduire significativement les temps d’analyse tout en maintenant de très bonnes performances quantitatives.

Les différentes approches LC rapides ne permettent pas uniquement de réduire le temps nécessaire à la procédure de validation, mais également de générer un plus grand nombre d’analyses par unité de temps pour l’utilisation de la méthode en routine.