Comparaison des méthodes

A actividade das autolisinas tem sido relacionada com numerosos fenómenos bacterianos: crescimento celular (Rogers, 1970, 1979; Shockman et ai., 1974), divisão e separação celulares (Fan, 1970; Pooley et ai ., 1972; Chatterjee et ai. , 1976; Rogers, 1979), "turnover" da parede (Chatterjee et ai., 1976; Pooley, 1976; Doyle et ai., 1981), transformação genética (Stewart & Marmur, 1970; Ranhand et ai, 1971), formação de flagelos (Fein, 1979; Pooley & Karamata, 1984a, 1984b), etc.

O numeroso trabalho que tem sido realizado neste domínio, nem sempre tem gerado consenso acerca destas funções. Tem sido impossível atribuir com exactidão a função biológica precisa das autolisinas, dadas as dificuldades de obtenção de mutações nos genes que codificam estas enzimas. Contudo, a sugestão de Pooley & Karamata (1984a, 1984b) de que a actividade autolítica de B. subtilis está sob o controlo dos genes "fia" e parece ser necessária à flagelação e a caracterização de um mutante de S. pneumoniae , completamente desprovido de amidase (sem o gene lyt A), parece abrir novas prespectivas no sentido de um esclarecimento total do pa- pel das autolisinas (Lopez et ai., 1987).

Nesta introdução apenas nos referiremos a algumas destas possíveis funções - as que mais directamente se relacionam com o trabalho que realizámos.

2.1.1.1. Crescimento celular

Em 1964, Weidel & Pelzer propuseram um modelo para o crescimento e expansão do peptidoglicano. De acordo com este modelo, durante o crescimento das bactérias, a expansão do peptidoglicano ocorria pela acção conjunta e controlada de enzimas sintéticas e enzimas autolíticas (autolisinas). As enzimas autolíticas produziriam fendas no peptidoglicano existente e, nesses mesmos locais, novas unidades dissacarídicas seriam introduzidas devido à acção de enzimas sintéticas.

Até há 5 anos, a lise observada em S. faecium após a inibição do peptidoglicano (quer pela adição de um antibiótico, quer pela falta de um constituinte essencial da

parede) parecia poder ser explicada de acordo com o seguinte modelo: a lise ocorreria devido à actividade contínua da autolisina E-l e à simultânea inibição da síntese do peptidoglicano. Contudo, S. faecium possui outra hidrolase do peptidoglicano, a E-2, que pode desempenhar uma tal função (Shockman et ai. , 1983,1987).

Segundo o mesmo modelo, os mutantes deficientes na actividade autolítica não deveriam degradar as suas paredes celulares sobrevivendo mesmo durante a inibição da síntese do peptidoglicano; por outro lado, não deveriam ser capazes de crescer normalmente, existindo apenas como mutantes letais. Surpreendentemente, as propriedades destes mutantes têm apenas confirmado a primeira, mas não a segunda das previsões acima feitas (Tomasz, 1984).

Têm sido isolados mutantes deficientes na actividade autolítica em várias espécies bacterianas.

Os mutantes (AUT-1, AUT-2 e AUT-3) isolados de S. faecium (Shungu et ai., 1979) e um dos mutantes (NH-4) isolado de B. licheniformis 6346 (Forsberg & Rogers, 1974), deficientes na actividade autolítica, crescem a taxas inferiores às das respectivas estirpes selvagens de onde foram isolados. O crescimento do mutante fi A177 de B. subtilis pode ser inibido em condições que impedem a produção das enzimas autolíticas; o rápido crescimento do mutante pode ser restabelecido pela adição de lisozima ou de um extracto contendo autolisina da estirpe selvagem ao meio de crescimento (Fan & Beckman, 1971; Fan et al, 1972).

No entanto, mutantes de B. subtilis que exibem uma deficiência de 90-95 % na sua actividade autolítica, crescem a taxas normais; além disso, as paredes destes mutantes são hidrolizadas pela autolisina da estirpe selvagem e possuem uma composição química igual à daquela estirpe (Fein & Rogers, 1976). Idêntico comportamento apresenta um mutante de S. aureus que possui uma taxa de autó- lise das células e de paredes celulares isoladas 90 % inferior à da estirpe selvagem; no entanto, a composição das suas paredes e as taxas de crescimento são idênticas às daquela estirpe (Chatterjee et ai., 1976).

Recentemente isolou-se o primeiro mutante de S. pneumoniae, M-31, que possui uma deleção completa no gene lyt A que codifica para a amidase verifican- do-se que a completa ausência da autolisina não impede o crescimento deste

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mutante a uma taxa normal (Sanchez-Puelles et al., 1986; Lopez et al., 1987)

Em resumo, os resultados obtidos com mutantes deficientes na actividade autolítica não permitem chegar a um consenso acerca do envolvimento das autolisinas no crescimento celular.

2.1.1.2. Divisão e separação celulares

Têm sido isoladas de uma grande variedade de espécies, nomeadamente em

B. subtilis (Fein & Rogers, 1976; Williamson & Ward, 1981), em B. licheniformis

NTC 6346 e ATCC 9945 (Forsberg & Rogers, 1974; Robson & Baddiley, 1977), em S.

faecium ATCC 9790 (Pooley et al., 1972) e em S. aureus (Chatterjee et al ., 1976),

mutantes deficientes na actividade autolítica incapazes de completar a separação normal, originando cadeias. Contudo, este fenótipo pode também ser originado quer pela modificação na composição química da parede, quer pelos efeitos combinados da baixa actividade autolítica e modificações na composição química das paredes, que as tornam resistentes à autólise (Forsberg & Rogers, 1974). Assim, no mutante de B.

licheniformis resistente à novobiocina, a deficiência no ácido teicurónico conduz à

formação de cadeias (Robson & Baddiley, 1977).

Porém, nem todos os mutantes deficientes na actividade autolítica crescem em cadeia. De um grupo de três mutantes deficientes na autolisina, isolados de S.

faecium por Shungu et ai (1979) dois, denominados AUT-2 e AUT-3, crescem em

cadeias formadas por longos filamentos, mas um outro, denominado AUT-1, não mostra este fenótipo.

Os dados acumulados sobre a participação da autolisina na separação celular, não têm sido apenas obtidos em mutantes deficientes na actividade autolítica. O crescimento em cadeia da eslirpe selvagem de B. subtilis , a altas temperaturas, é devido a uma deficiência na actividade autolítica (Fan, 1970). A adição ao meio de cultura da autolisina de B. subtilis , parcialmente purificada, ou de lisozima provoca a separação das células (Fan, 1970). A adição de um inibidor da amidase ao meio de cultura de Pneumococos causa a formação de cadeias (Hõltje & Tomasz, 1975a, 1975b)

Contudo, a formação de longas cadeias em estirpes com níveis elevados de actividade da amidase (mutante M-51) ou em estirpes onde a enzima falta (mutante M 31) não pode ser atribuída à amidase. Por outro lado, o mutante M-31 isolado de

S. pneumoniae , em contraste com a estirpe selvagem, não autolisa na fase

estacionária de crescimento quando incubado a 37 °C; contudo, este mutante autolisa a 30 °C (Lopez et ai., 1987).